二代测序在脓毒血症患者病原学诊断中的应用

朱逸敏，张文宏

复旦大学附属华山医院,上海 200040

脓毒血症是一种严重威胁生命的感染，近年来其发病率呈不断上升之势，且病死率居高不下[1-2]。诊断脓毒血症后尽早予以抗菌药物是治疗成功的关键之一，而精准、快速的病原学诊断可帮助临床医师及时优化抗菌药物的使用。目前，基于培养的病原学诊断方法(如血培养、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等)仍是脓毒血症病原学诊断的主要手段[3-4]，但有不可忽视的缺点，如培养时间较长，需数天才能鉴定； 无法检测苛养菌、胞内菌、病毒等无法常规培养的病原体。为解决以上问题，近年来出现了一些不依赖培养的病原学诊断方法。其中基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法发展较为成熟，一批商用检测试剂盒已入市[5]。然而，目前临床可用的PCR方法多仅能定性检测常见病原体，定量PCR仅局限于病毒及部分特定细菌的检测。

近年来，二代测序技术(又称高通量测序技术)不断成熟并普及，为病原学诊断提供了一种新的有力手段。测序过程中，直接提取标本中的全部核酸片段并加以检测，经生物信息学分析即可鉴定出标本中所含核酸的种类，并可获得病原体的序列数、覆盖度等定量分析数据。使用二代测序技术时，标本在检测前无须培养，避免了难以培养的病原体漏检；检测时可直接非特异性地测定全部核酸片段，无须事先选定检测范围(即无偏性)，最大限度地避免了漏检，还可同时检测宿主基因以辅助诊断；测序后可通过复查二代测序，比较治疗前后的病原体序列数等定量和半定量数据，对患者进行随访。

二代测序用于感染性疾病的诊断首次报道于2014年1例中枢神经系统钩体病患者[6]，此后广泛用于多种感染性疾病的诊断。中枢神经系统感染研究多集中于病毒检测，在这些报道中，二代测序在脑脊液中检出的病毒均通过了其他方法的验证，结果与临床情况吻合[7-8]。在呼吸道感染中，二代测序已用于多种呼吸道标本检测，包括痰、咽拭子、肺泡灌洗液等，并表现出良好的诊断性能[9-10]。除上述标本，血液标本亦为二代测序的重要应用领域。本文对目前二代测序在脓毒血症患者病原学诊断方面的研究进行综述。

截至2017年11月30日，以“sepsis” “bacteremia” “bloodstream infection” “next generation sequencing”及“high-throughput sequencing”为关键词，在PubMed、Embase、Cochrane数据库中检索，获英文文献60篇；以“菌血症”“败血症”“脓毒血症”“血流感染”及“二代测序”为关键词，在中国知网数据库中检索，获中文文献6篇。经筛选，11篇文献与二代测序在脓毒血症病原学诊断中的应用有关，均为英文文献，其中3篇与病原体核酸检测相关[11-13]，8篇与宿主基因检测有关[14-21]。

1 二代测序在脓毒血症病原体检测中的研究

1.1 研究进展

目前已有的3项二代测序在脓毒血症病原体检测中的研究均为队列研究。隆云等[11]在北京协和医院重症监护室(intensive care unit，ICU)开展的单中心研究纳入78份脓毒血症患者血样。就细菌及真菌而言，最终有8份标本培养及测序均阳性，3份标本培养阳性而测序阴性，9份标本培养阴性而测序阳性。以培养结果为“金标准”，二代测序的灵敏度及特异度分别为 72.7% 和 89.6%；采用血培养联合二代测序诊断细菌或真菌感染，阳性率较单用血培养显著升高(23.08% 和 12.82%，P=0.013)。此外，通过二代测序还在14份血样中检测到15种病毒，且均通过桑格法测序验证。这表明二代测序联合血培养可进一步提高病原学诊断的阳性率。值得注意的是，在3份测序假阴性标本中，2份细菌阳性标本(鲍曼不动杆菌及粪肠球菌)桑格法测序均为阴性，表明送检样本中DNA含量可能低于检测下限；而1份真菌阳性标本(白假丝酵母)桑格法测序阳性，提示检测真菌等较难裂解的病原体时，二代测序存在一定的假阴性。

Grumaz等[12]进行了一项基于ICU的单中心研究，共纳入60例脓毒性休克患者、30例术后非感染患者及30例健康志愿者。该研究尝试对测序结果进行定量分析，并直观比较二代测序与临床情况的关联度。基于健康人群血样的测序结果，他们建立了每个菌种DNA序列数在正常人群中的分布情况，进而基于待测样本的序列数绝对值与序列数偏离正常分布的程度，计算获得脓毒症指数。研究发现，脓毒血症患者中致病菌的脓毒症指数绝对值、丰度均显著升高，且变化情况与临床表现密切相关，一旦开始有效治疗，脓毒症指数即迅速下降。此研究不仅验证了二代测序用于病原学诊断的可行性，还尝试建立了一种判别致病菌的方法，从检测出的大量杂菌中较为可靠地鉴别出致病菌。

Gosiewski等[13]比较了健康志愿者与脓毒血症患者的测序结果，发现健康志愿者血样中的放线菌门丰度显著高于脓毒血症患者(76.3% 和 31.0%，P<0.001)，而变形菌门丰度显著低于脓毒血症患者(16.4% 和 60.1%，P<0.001)。健康志愿者血样的测序结果主要为厌氧菌(76.2%)，以双歧杆菌(73.0%)等非致病菌为主；而脓毒血症患者血样的测序结果以需氧菌或微量需氧菌为主(75.1%)，且大多数患者标本中可测得有临床意义的致病菌种。Grumaz等[12]的研究结果亦发现，在健康人群中，以痤疮丙酸杆菌为主的放线菌门贡献了大部分游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)序列数。这两项研究为进一步判断所检出的病原体性质奠定了基础。

1.2 目前存在的挑战

1.2.1污染和致病菌的判读目前，所有二代测序研究均显示可在健康人血样中检出多种微生物的序列，脓毒血症患者亦如此，因此判断所检出的微生物为致病菌还是污染菌显得尤为重要。cfDNA定量分析是二代测序的特点之一，测得的DNA序列数、覆盖度、相对丰度等信息在判断病原体性质方面可能有一定帮助。

Grumaz等[12]提出的脓毒症指数综合了序列数绝对值及其偏离正常的程度并以此进行判断，可明显放大序列数的异常程度。当病原体的序列数接近判断阈值时，用脓毒症指数比直接基于序列数进行结果判断更为可靠。虽然其研究样本量较小，且未经其他研究验证，但仍值得参考。

隆云等[11]则从测序覆盖度、序列数、临床医师意见3个方面进行判断，病原体需满足3点方认为是致病菌：其测序覆盖度需位列全部检出病原体的前十；其序列数需>3且大于正常上限(正常上限为健康志愿者中该病原体序列数的第三四分位数+3倍四分位距)；符合临床医师根据临床症状得出的判断。然而，这种判断方法存在一定问题：测序覆盖度与病原体基因组大小有关，病毒的测序覆盖度常远高于细菌、真菌及寄生虫，可能导致有意义的病原体被遗漏；此外，真菌、分枝杆菌等部分有临床意义的病原体可能因为其胞壁较厚，DNA难以释放入血，导致其测得的序列数较低，覆盖度亦较低。

二代测序可在血液中检测出大量非致病微生物序列，对测序结果的判读常需结合临床综合判断。现有研究尚未给出单纯基于测序结果判断污染菌或致病菌的标准，二代测序的定量分析优势尚未发挥，有待进一步研究。

1.2.2抗微生物治疗对测序结果的影响理论上，死菌释放的DNA也可被测出，因此二代测序对抗感染治疗后的患者诊断灵敏度应较高。然而，cfDNA的半衰期短至数分钟，使病原体序列数与病情变化高度相关，测序结果极易受治疗的影响。Grumaz等[12]研究显示，治疗后数日内脓毒症指数即显著下降，提示抗微生物治疗对测序结果有巨大影响：在接受经验性治疗后的患者中，也许应采取更为宽松的病原体判读标准以提高阳性率。此外，序列数与病情变化的相关性也揭示了一种可能，即序列数显著下降或消失是否可用于抗感染药物疗程的优化。关于这些问题，尚待有力的循证医学证据支持。

1.2.3病原体耐药基因检测二代测序具有非特异性的特点，理论上可检测包括耐药基因在内的全部核酸序列。Grumaz 等的研究验证了二代测序检测耐药基因的可行性[12]。但目前研究中细菌、真菌测序的覆盖率仍较低，常仅能满足种属鉴定的需要，不能有效覆盖耐药基因的检测。因此，在二代测序获得病原体鉴定结果后，临床医师有时仍需根据经验选用药物。这一缺陷可能与血液中病原体核酸含量远低于宿主核酸含量，且cfDNA半衰期较短有关[22]。目前，二代测序在脓毒血症诊断方面的研究仍集中于病原体鉴定，在耐药性检测方面尚缺乏较为系统的研究。

2 二代测序在宿主核酸检测中的研究

在感染性疾病中宿主与病原体同等重要。脓毒血症患者血样中仍有90%以上的cfDNA来自宿 主[11-12,14-15]，检测宿主DNA及微小RNA(microRNA，miRNA)在脓毒血症诊断中可能有一定作用。无偏性的特点还可使二代测序在检测病原体核酸的同时对宿主DNA及miRNA进行检测。

2.1 cfDNA在脓毒血症与非感染性疾病中的鉴别诊断价值

3项研究通过二代测序发现，脓毒血症患者血样中总cfDNA序列数与健康志愿者相比有上升趋势[14-16]，但在术后无感染患者中cfDNA序列数亦呈上升趋势[11]。此外，在肿瘤[23]、创伤[24]、卒中[25]等患者中，cfDNA含量亦可升高。对cfDNA进行电泳后，均呈凋亡相关的片段长度模式[26-27]，表明脓毒血症患者中cfDNA含量增加可能来自非特异性的组织破坏，而不是感染所致的特异性病理生理学变化，因此二代测序用于脓毒血症诊断价值有限。另一方面，研究发现在脓毒血症患者中，虽然宿主cfDNA占总cfDNA的比例有所下降，但这一趋势源于病原体DNA含量增高[11-12]，此时常可直接根据病原体DNA测序结果进行判读。因此，宿主来源cfDNA含量的变化趋势在鉴别感染性因素中意义有限。

2.2 miRNA在脓毒血症中的鉴别诊断价值

病原体与宿主的相互作用可导致宿主基因调控、表达等发生变化。miRNA作为重要一环，对其进行测序可能有助于脓毒血症的病原学诊断。现有的4项研究均基于脓毒血症患者与非感染性炎症反应综合征患者的对比，筛选出大量脓毒血症患者中表达水平有变化的miRNA[17-20]。此外，Reithmair等[20]的研究更揭示了血液中miRNA水平的空间特异性。与健康人相比，脓毒血症患者在血清、外泌体和血细胞3个不同空间中共发现77个下调miRNA及103个上调miRNA，主要为血细胞来源的miRNA(62.14% 上调miRNA，64.94% 下调miRNA)；仅 2.91% 的上调miRNA及 3.90% 的下调miRNA在3个空间中的变化趋势一致。

除鉴别非感染性因素外，miRNA水平变化还可帮助判断可能的病原体种类。Dix等[21]比较了白假丝酵母感染、曲霉感染、脂多糖处理后血清中树突细胞的miRNA表达水平变化，筛选到一些miRNA的表达差异，并可追溯至相应基因水平。这为解读测序结果，帮助判断可能病原体提供了一定的帮助。

在血液脓毒血症病因鉴别方面miRNA测序已展示出一定潜力，miRNA水平变化也许能帮助判读病原体DNA的测序结果。但目前研究尚处于探索阶段，多为脓毒血症患者与大型手术后全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)患者的病例-对照研究，且样本量较小；其筛选获得的miRNA尚缺少队列研究的验证，且在中国人群中尚未进行验证。

3 结语

在脓毒血症诊断中，二代测序技术显示了独特优势，其快速、无偏的特性较好地补充了传统病原学诊断方法的不足，有一定的临床应用价值。然而，二代测序尚存在缺乏公认的判读标准、测序结果与治疗关系不明确、耐药基因难以检测等不足之处，亦缺乏与传统诊断方法较大规模的比较验证。随着相关研究的完善，二代测序在脓毒血症诊断中的临床应用价值将得到进一步提升。

除对病原体基因进行测序外，对脓毒血症患者miRNA进行测序已显示出一定的诊断价值。目前已筛选出一系列潜在的可用于鉴别非感染性炎症反应或病原体种类的miRNA，且发现miRNA水平在空间分布上的差异。但多为脓毒血症患者与手术后患者的病例-对照研究，筛选出的miRNA尚未在中国人群中进行较好验证。因此，其诊断性能有待更高级别的循证医学证据支持。

此外，检测价格亦是限制二代测序技术推广的重要因素，但近年来测序成本快速下降。全基因组测序在2001年需耗费100万美元；在二代测序技术的帮助下，2011年降至1万美元。在国产测序技术的推动下，2017年病原体二代测序的成本降至每份标本 3 000 元人民币左右。因此，有理由相信，未来几年中采用二代测序检测病原体的成本将很快逼近甚至低于血培养，从而大大推动其临床应用。

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