赤水晒醋中腐败微生物的生长特性研究

何银，唐杰，张惟广

(西南大学 食品科学学院，重庆 400715)

食醋作为一种日常调味品，“多醋少盐”、“重醋轻盐”已成为现代人餐桌上的一种时尚追求[1]。醋含有氨基酸、糖类、维生素等营养成分，具有抗菌、杀菌等药理功效[2]，并有助于防止感冒、腹泻、骨质疏松等[3]。赤水晒醋采用传统固态发酵生产方式，拥有悠久的历史。固态发酵(solid-state fermentation, SSF)指在没有或者几乎没有游离水的湿的固态天然物料作为培养基中培养微生物的发酵过程。其底物多是不溶于水的聚合物，它为微生物提供生长所需碳源、氮源、无机物、水分以及其他营养物质并给微生物提供固定生长场所。固态发酵的本质是在特定发酵条件下，利用微生物对发酵基质中有机物的分解、代谢过程积累代谢产

物[4,5]。但固态发酵以手工操作为主，大部分依靠经验和积累，设备陈旧，生产周期长[6]，产品体态不够澄清，保质期内会在瓶口出现浮圈，瓶底形成沉淀，这些现象影响了食醋的感官，甚至影响食醋品质[7]。

本试验以从赤水晒醋的腐败醋中分离出的4株腐败菌(枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、类芽孢杆菌(Paenibacillussp.Dg-1009)、耐热芽孢杆菌(BacillussporothermoduransTCA20028)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)为研究对象，探究其在不同温度、盐度、酸碱度、防腐剂等因素下的生长状况，并且确定这几种微生物耐受高温的温度与时间，为解决食醋腐败问题提供理论参考。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

正常醋与腐败醋由贵州赤水黔老翁醋厂提供；J1枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、J2类芽孢杆菌(Paenibacillussp.Dg-1009)、J4耐热芽孢杆菌(BacillussporothermoduransTCA20028)、J7地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)由该醋厂的腐败醋中分离得出。

琼脂粉、氯化钠、山梨酸钾、苯甲酸钠 成都市科龙化工试剂厂；牛肉膏、蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

FA2004A型分析天平 上海精天电子仪器有限公司；PHS-3E型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DPH-9162型电热恒温培养箱、DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；UV1000型可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；DPH-9162型恒温培养振荡器 上海智诚分析仪器有限公司；SW-CJ-1FD型洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化

取出保存于冰箱中的菌种，划线于牛肉膏蛋白胨做成的平板培养基，并于(36±1) ℃培养24 h，活化2次。挑取1环菌种加入已灭菌的50 mL牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，于(36±1) ℃摇床(转速50 r/min)培养24 h。

1.3.2 测定方法

1.3.2.1 比浊法

采用吸光值来判定培养液中微生物数量，用分光光度计在600 nm处测定样品的吸光度[8]。

1.3.2.2 菌落计数法

按照GB/T 4789.2-2016的方法进行计数。

1.3.3 不同因素对5种菌生长的影响

参考生产工艺条件并结合前人的研究制定了如下因素条件[9,10]，探究其在不同条件下的生长状况。将制备好的J1，J2，J4，J7的菌悬液接种于50 mL的营养肉汤培养基中，使接种后的浓度为105～106cfu/mL，于37 ℃摇床(90 r/min)培养24 h后测定菌液的OD600 nm值[11]，以下试验均采用此接种和培养方法。

1.3.3.1 温度

在温度为10，15，20，25，30，35，40，45，50 ℃下培养，平行3次，并做空白对照。

1.3.3.2 盐浓度

在氯化钠含量分别为0，2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%的50 mL营养肉汤培养基中，平行3次，并做空白对照。

1.3.3.3 pH

用1 mol/L氢氧化钠和1 mol/L盐酸调节营养肉汤培养基的pH为3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，平行3次，并做空白对照。

1.3.4 杀菌处理、防腐剂对菌株生长的影响

1.3.4.1 杀菌温度对菌株生长影响

在0，80，90，100，110，120 ℃下分别处理20 min，平行3次，并做空白对照。

1.3.4.2 杀菌时间对菌株生长影响

按照如下条件处理： 90 ℃分别处理0，5，10，15，20，25，30 min；100 ℃分别处理0，5，10，15，20，25，30，35，40 min，平行3次，并做空白对照。

1.3.4.3 防腐剂对菌株生长影响

本研究选用山梨酸钾和苯甲酸钠这2种防腐剂作为研究对象，根据GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》进行添加量的选择，本实验选用0.25，0.5，1 g/L 3个浓度的苯甲酸钠和山梨酸钾，添加到液体培养基中。

a.不同浓度防腐剂的配制

为较少误差，加入防腐剂的体积不应太大，因此配制高浓度的母液。首先用无菌水配制100 g/L山梨酸钾母液，浓度1 g/L山梨酸钾的配制：在无菌条件下，吸取0.5 mL山梨酸钾母液加入到已灭菌的50 mL营养肉汤培养基中，其他浓度防腐剂的配制如上述方法所示。

b.菌悬液接种

将制备好的菌悬液接入已经加入不同浓度防腐剂的液体培养基中，每株菌平行2次并做空白对照，按照1.3.3.1的方法进行培养。

c.结果测定

对4株菌平板计数参考GB/T 4789.2-2016，根据结果计算出菌落总数，并按照以下公式计算抑菌率，由公式可以看出，抑菌率越大，防腐效果越好。

IR(%)=(k0-k)/k0×100。

式中：IR为抑菌率；k0为对照组菌落总数；k为添加不同防腐剂的菌落总数。

1.3.5 数据分析

使用Oringe软件进行作图，使用SPSS软件分析及处理数据，显著性采用Duncan's多重比较法(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 培养温度对菌株生长的影响

J1，J2，J4，J7菌株在10，15，20，25，30，35，40，45，50 ℃下培养24 h后的OD600 nm值见图1。

图1 培养温度对菌株生长的影响Fig.1 Effect of the culture temperature on the growth of strains

由图1可知，在处理温度范围内，随温度升高，4株菌的OD值均呈先升高后下降的趋势。J1，J2，J7菌株在35 ℃时生长最好，其OD值分别为1.401，0.389，1.359。J4在40 ℃时OD值为0.437，达到最大。菌株J1，J2，J4，J7在培养温度低于35 ℃时生长逐渐缓慢，在15 ℃时，OD值均小于0.1，生长受到抑制，在10 ℃时，OD值接近零，几乎不生长。因此，可于15 ℃储存食醋，以抑制腐败菌生长。

2.2 含盐量对菌株生长的影响

J1，J2，J4，J7菌株在氯化钠含量分别为0，2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%的培养基中生长24 h后，测得菌液OD值的变化，见图2。

图2 含盐量对J1，J2，J4，J7菌株生长的影响Fig.2 Effect of sodium chloride content on the growth of J1，J2，J4，J7 strains

由图2可知，在氯化钠含量低于2%时，4株菌都能生长，且生长良好，J1，J2，J4，J7菌株均在氯化钠含量为0时生长最好，OD值分别为1.316，0.420，0.347，1.426。在4株菌中J1，J7能耐受12%的含盐量，较为耐盐，J2，J4耐盐性较差，最大耐受量分别为6%，5%。由试验结果可知，4株芽孢杆菌具有较强的耐盐性，在含盐量为12%时菌株的生长基本受到抑制，含盐量低于2%时菌株生长良好，本试验所用醋的含盐量为(1.97±0.02)%，为抑制菌株生长可将盐分含量提高至3%，但仍需结合杀菌等其他控制条件。

2.3 pH对菌株生长的影响

J1，J2，J4，J7菌株在pH 3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8条件下培养24 h后，测得的菌液OD值变化，见图3。

图3 培养pH对菌株生长的影响Fig.3 Effect of culture pH on the growth of strains

由图3可知，在处理pH范围内，随pH升高4株菌OD值呈先升高后下降的趋势，J1，J2，J4，J7菌株在pH 7.0时，生长最好，OD值分别为1.362，0.408，0.449，与其他pH处理比差异显著。4株菌在pH 3.0时OD值接近0，菌株基本不生长。由结果可知，芽孢杆菌的耐酸性较强，本试验所用醋的pH为3.6±0.03，虽能抑制部分菌株的生长，但仍有耐酸的芽孢杆菌生长，因此需要严格控制杀菌，以更好地抑制腐败微生物的生长。

2.4 杀菌温度对菌株生长的影响

J1,J2,J4,J7菌株在经过不同温度处理20 min后，培养24 h得到的菌液OD值见图4。

图4 杀菌温度对J1，J2，J4，J7菌株生长的影响Fig.4 Effect of sterilization temperature on the growth of J1，J2，J4，J7 strains

由图4可知，杀菌温度从80～110 ℃，OD迅速下降，随着杀菌温度上升，OD值降低。在100 ℃杀菌20 min时，OD值明显降低，说明一般生产中的100 ℃杀菌可以杀死大部分腐败菌，但是仍有菌株残留。当处理温度达到120 ℃时，4株菌几乎全被灭活，由此可知，芽孢杆菌耐高温的能力较强。但在实际生产过程中，杀菌温度过高会增加生产成本，甚至引起食醋口感变差，因此本试验选择较为适中的90 ℃和100 ℃进行杀菌温度的探究。

2.5 杀菌时间对菌株生长的影响

2.5.1 90 ℃处理不同时间对菌株生长的影响

J1，J2，J4，J7菌株在90 ℃下处理0，5，10，15，20，25，30 min后，经过24 h培养后得到的菌液浓度的OD值见图5。

图5 90 ℃高温处理对J1，J2，J4，J7菌株生长的影响Fig.5 Effect of high-temperature processing at 90 ℃on the growth of J1,J2,J4,J7 strains

由图5可知，J1，J2，J4，J7菌株在90 ℃，20 min处理后OD值变化均不显著，90 ℃的处理并不能达到很好的灭菌效果，因此，采用100 ℃再次处理，并延长处理时间。

2.5.2 100 ℃温度处理不同时间对菌株生长的影响

J1,J2,J4,J7菌株在100 ℃下处理0，5，10，15，20，25，30，35，40 min处理后，经24 h培养得到的菌液OD值见图6。

图6 100 ℃高温处理对J1,J2,J4,J7菌株生长的影响Fig.6 Effect of high-temperature processing at 100 ℃ on the growth of J1,J2,J4,J7 strains

由图6可知，在100 ℃时，J1,J7菌株需要处理35 min，J2,J4菌株需要处理30 min才能将菌株灭活。本试验研究的4种腐败菌均为芽孢杆菌，耐热性较好，为尽量延长食醋的保质期，可在较低温度下储存食醋，并在保证口感的前提下可稍提高含盐量，降低酸度，宜采用100 ℃左右的高温杀菌35 min。

2.6 防腐剂抑菌效果

不同浓度的防腐剂对菌株J1,J2,J4,J7生长的影响结果见表1和表2。

表1 不同浓度山梨酸钾对菌株生长的影响Table 1 Effects of different concentration of potassium sorbate on the growth of strains

表2 不同浓度苯甲酸钠对菌株生长的影响Table 2 Effects of different concentration of sodium benzoate on the growth of strains

2.6.1 防腐剂对J1菌株的影响

不同浓度的防腐剂对J1菌株的抑菌率结果见图7。

图7 防腐剂对J1菌株的影响Fig.7 Effects of preservative on J1 strain

由图7可知，2种防腐剂对J1菌株的抑菌率都在94%以上，当2种防腐剂按照1 g/L的浓度添加时，山梨酸钾和苯甲酸钠的抑菌率分别97.65%,96.47%，山梨酸钾效果较优。

2.6.2 防腐剂对J2菌株的影响

不同浓度防腐剂对J2菌株的抑菌率结果见图8。

图8 防腐剂对J2菌株的影响Fig.8 Effects of preservative on J2 strain

由图8可知,在3种浓度下，苯甲酸钠对J2菌株的抑菌率均在99%以上，苯甲酸钠对J2菌株的抑菌率优于山梨酸钾。

2.6.3 防腐剂对J4菌株的影响

不同浓度防腐剂对J4菌株的抑菌率结果见图9。

图9 防腐剂对J4菌株的影响Fig.9 Effects of preservative on J4 strain

由图9可知，当按照1 g/L的浓度添加时，山梨酸钾和苯甲酸钠对J4菌株的抑菌率分别为99.25%，95.18%，山梨酸钾的抑菌效果优于苯甲酸钠。

2.6.4 防腐剂对J7菌株的影响

不同浓度的防腐剂对J7菌株的抑菌率结果见图10。

图10 防腐剂对J7菌株的影响Fig.10 Effects of preservative on J7 strain

由图10可知，2种防腐剂对J7菌株的抑菌率均在96%以上，不同浓度的山梨酸钾对J7菌株的生长影响较大，在最大浓度时抑菌率达到98.53%。在浓度大于0.5 g/L时的抑菌效果差别并不大，但苯甲酸钠稍优于山梨酸钾。

根据防腐剂试验得出：若是要同时抑制食醋中的这4种菌，山梨酸钾效果优于苯甲酸钠，山梨酸钾在最大浓度添加时，对J1菌株的抑菌率为97.65%，对J2菌株的抑菌率为96.72%，对J4菌株的抑菌率为99.25%，对J7菌株的抑菌率为98.53%。由表1和表2可知，虽然防腐剂对腐败菌的生长有一定的抑制效果，但是若初始菌浓度过高，添加防腐剂后的菌浓度仍然较高，因此，若是杀菌条件控制不好，仅通过添加防腐剂不能保证产品品质。

3 结论

J1,J2,J4,J7菌株在15 ℃时生长很微弱，在温度为10 ℃时几乎不生长；J1，J2，J4，J7菌株能耐受的最大盐度分别为12%，6%，5%，12%；在pH 4.0以下时，所有菌株生长微弱，受到抑制，pH 3.0时OD值接近0，不能生长。若杀菌时间在20 min时，应选用120 ℃才能完全灭活，选用100 ℃杀菌时，需要处理35 min才能将菌株灭活。若是要同时抑制食醋中的这4种菌，山梨酸钾的效果优于苯甲酸钠，在最大浓度添加时，对这4株菌的抑制率均为96%以上。

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