桑抹茶对高脂血症模型大鼠胸主动脉LXRα、PPAR蛋白表达的作用研究*

楼招欢李波俞静静吕圭源

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

2 浙江省中药治疗高血压及相关疾病药理研究重点实验室 浙江 杭州 310053

桑抹茶是新鲜桑叶经特殊抹茶工艺制成的天然超细粉末，前期研究显示其具有良好的降血脂作用，并具有促进胆固醇逆转运潜能[1]。本文拟进一步观察桑抹茶对高脂血症模型大鼠胸主动脉形态及胆固醇流出相关蛋白表达的影响，探讨其抗动脉粥样硬化的作用及可能机制。

1 实验材料

1.1 动物：SD大鼠，雄性，体重200±20g，40只，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（浙）2014-0001，动物合格证号：NO.0016674。于室温23±2℃，相对湿度50%～70%饲养，自由饮食饮水。

1.2 药物与试剂：阿托伐他汀（Atorvastatin Calcium Capsules，河南天方药业股份有限公司131010109，10mg/粒），临用前用蒸馏水配制成浓度为0.6mg/mL的混悬液。桑抹茶由新鲜桑叶冷冻干燥后经球磨机碾碎成超细粉末，临用前取上述样品适量，用纯水配置成90、60、30mg/ml的混悬液，即得。胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒均购自宁波美康生物科技有限公司；一氧化氮试剂盒（NO，20151228，南京建成科技有限公司）；DAPI、FITC标记山羊抗兔IgG（H+L）(A0562，碧云天)；免疫组化二抗试剂盒（ab64264，abcam公司）；肝X受体α（LXRα；YT5143，Immuno Way）、过氧化物酶体增殖物激活受体α/γ（PPARα/γ；15540-1-AP，Proteintech和YM3443，Immuno Way）、高脂饲料购自特洛菲饲料科技有限公司。

1.3 仪器：ACCUTE TBA-40FR全自动生化分析仪（东芝三厂医疗株式会社）；Power wave 340酶标仪（美国Bio-TEK仪器有限公司）；SAKURA Tissue-Tek VIP 5Jr自动脱水机，日本樱花检验仪器株式会社；MEIKO EC360包埋机，德国MEIKO公司；LEICARM2245切片机，德国LEICA公司；生物显微镜BA410，Motic公司；Adavance 3.2图像分析系统，Motic公司。

2 实验方法

2.1 分组与给药：将大鼠适应性喂养7d后，称定体质量，随机分为正常对照组和造模组，除正常对照组大鼠外，其余大鼠给予高脂饲料，2周后禁食12h后眼眶静脉丛采血，测定血清中TC水平，根据TC水平随机分为5组：正常对照组、模型对照组、阳性对照组（阿托伐他汀6.0mg/kg）、桑抹茶组(900、600、300mg/kg)，每组8只。所有大鼠均给予高脂饲料，连续4周，自由采食饮水。同时除正常对照组和模型对照组灌服蒸馏水外，其余各给药组分别灌胃给予相应剂量的药物，每日1次，灌胃容积为1ml/100g体质量，连续4周。

2.2 血脂水平检测：于给药后第4周眼眶取血（取血前禁食不禁水12h），37℃水浴1h，3500r/min，离心10min，取上清液即血清，全自动生化分析仪检测大鼠血清血脂生化指标（TC、TG、LDL-C、HDL-C），并计算动脉硬化指数（AI=(CTC-CHDL-C)/CHDL-C）。

2.3 血清一氧化氮水平检测：实验期末，眼眶采血，37℃水浴1h，3500r/min，离心10min，取上清，按照说明书采用硝酸还原酶法测定血清中NO水平。

2.4 HE染色观察胸主动脉组织病理学：各组大鼠解剖后取胸主动脉相同部位，4%中性福尔马林缓冲溶液固定72h，常规脱水，石蜡包埋，切片、HE染色，中性树脂封片，光镜下观察组织病理学改变。

2.5 主动脉PPARγ/α、LXRα表达的检测：采用免疫组化法和免疫荧光法。主动脉石蜡切片免疫组化DAB显色法：梯度二甲苯脱蜡→梯度乙醇水化→抗原修复→灭活内源性过氧化氢酶→5%BSA封闭→孵育抗PPARγ/α、LXRα一抗或PBS→孵育二抗→DAB显色→苏木素染核→脱水→二甲苯透明→封片→镜下观察，黄色为阳性表达结果；同时设置PBS代替抗PPARγ/α、LXRα一抗的同步阴性对照。石蜡切片PPARγ免疫荧光染色：梯度二甲苯脱蜡→梯度乙醇水化→抗原修复→5%BSA封闭→孵育PBS或抗PPARγ一抗→孵育FIFC标记的荧光二抗→DAP1染核→防荧光淬灭封片剂封片→荧光倒置显微镜下观察；绿色荧光为PPARγ阳性表达，蓝色荧光为细胞核的表达。

3 实验结果

3.1 对血脂水平的影响：图1结果显示，与正常组比较，给予高脂饲料2w后，各模型组大鼠血清TC、LDL-C水平显著升高（P＜0.01），HDL-C水平显著降低（P＜0.01），动脉粥样硬化指数AI显著增大（P＜0.01）；各造模组大鼠TG水平有增高趋势，但各组间无显著性差异（P＞0.05）。给予桑抹茶（FM）干预4w后，与模型组比较，FM各剂量组大鼠血清TC、LDL-C水平及AI均显著下降（P＜0.01，P＜0.05），0.9、0.6g/kg能显著增加模型大鼠血清HDL-C水平（P＜0.05，P＜0.01）；各组间TG水平无显著性差异。

3.2 对模型大鼠胸主动脉病变及血清NO水平的影响：HE染色表明，正常组大鼠胸主动脉壁由三层组成，内膜层有丰富的内皮细胞；中膜较厚，由多层弹性膜组成，弹性膜间有平滑肌、少量胶原纤维和弹性纤维；外膜较薄，由结缔组织构成；与正常组比较，模型组大鼠主动脉内皮细胞有脱落，弹性膜层排列紊乱，中膜增厚，并有轻微的早期脂纹。与模型组比较，FM各剂量组胸主动脉内膜脱落减轻，弹性膜层排列较整齐，中膜增厚有改善（图3A）。ELISA结果显示，与正常组比较，模型大鼠血清NO水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，FM0.9g/kg和0.6g/kg能显著升高血清NO水平（P＜0.01）（图3B）。

图1 造模2周各组大鼠血脂水平

图2 给药4周各组大鼠血脂水平

图3 A：胸主动脉HE染色代表性显微图片（200×）；B：各组血清NO水平

3.3 对主动脉PPARγ/α、LXRα蛋白表达的影响：免疫组化结果表明，PPARγ/α、LXRα在主动脉细胞核表达（见图4、5）；PPARγ免疫组化DAB显色法和免疫荧光的结果类似（见图5）。与正常对照组比较，模型组大鼠主动脉PPARγ、LXRα表达明显降低，PPARα有升高趋势，但无显著性差异；与模型对照组比较，FM各剂量组大鼠主动脉PPARγ、LXRα表达有增加趋势，PPARα有降低趋势，其中对LXRα和PPARα的作用以0.3g/kg剂量较为显著，对PPARγ的作用以0.9、0.6g/kg剂量较为明显。

图4 主动脉PPARα、LXRα表达代表性显微图片（DAB染色，200×）

图5 主动脉PPARγ表达代表显微图片（A：DAB染色，200×；B：荧光染色，200×）

4 讨论

AS是心脑血管病的病理基础，已知血脂代谢异常是其重要诱因。由异常升高的LDL氧化修饰形成的氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），侵入并沉积于血管内膜，损伤内皮细胞，触发炎症反应，由单核细胞黏附并活化的巨噬细胞通过清道夫受体吞噬ox-LDL形成泡沫细胞，促进了AS的发生发展。本文研究结果显示，与正常组比，模型大鼠给予高脂饲料6w后，血清中TC、LDL-C水平及AI显著升高，血管内皮细胞有脱落，单核细胞黏附于内膜，中膜增厚；给予FM干预，能有效降低TC、LDL-C及AI，改善内膜损伤，提示FM有一定的预防AS作用。

血管内皮功能紊乱是AS心血管病理生理改变的始动因素。内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生的NO，具有舒张血管、抗炎、抗血栓等作用，血管内皮细胞释放NO的减少，可导致血管舒缩功能紊乱，促进AS及高血压等的发生发展。研究表明，高脂血症可抑制eNOS的表达，减少NO的合成与释放[2]，降低血中NO浓度，减弱其抗AS的作用[3]。本文研究结果表明，模型大鼠血清NO水平显著降低，而不同剂量FM干预，能显著升高血清NO的含量，减轻主动脉病理改变程度。

肝X受体（LXRs）是一种氧化型固醇激活的核受体，其在胆固醇逆转运、糖代谢及炎症过程中起了重要作用，LXRα为其亚型之一。以往研究显示，LXRs通过调控靶基因ApoE、ABCA1、ABCG1等，促进胆固醇从细胞内流向细胞膜并转运至细胞外，阻止胆固醇在血管壁等过多的堆积，防止AS的发生发展。此外，LXRs与PPAR通路偶联，PPARγ通过降低清道夫受体（SR-A）的表达、增强CLA/SR-BI、ABCA1、LXR的表达，促进细胞内胆固醇流出，对泡沫细胞形成负性调节作用；此外，PPARγ表达上调在AS发生的最早期，可以通过抑制血管壁上单核/巨噬细胞介导的炎症反应来阻断AS的发生发展。本文研究结果显示，模型大鼠胸主动脉LXRα、PPARγ表达量明显低于正常组大鼠，给予FM干预，能有效增加模型大鼠血管LXRα、PPARγ表达量。提示，FM可能可以通过活化LXRα、PPARγ，促进血管壁巨噬细胞胆固醇流出，从而防止血管壁脂质沉积。

综上所述，桑抹茶通过降低高脂血症模型大鼠血清TC、LDL-C水平，增加血清NO水平及血管LXRα/PPARγ表达，促进胆固醇流出，改善血管内皮功能，具有潜在的抗AS作用。

[1]楼招欢，张光霁，苏洁，等.抹茶和桑抹茶对高脂血症模型大鼠血脂水平的作用[J].中成药，2016，38（7）：1594-1598.

[2]Sandoo A，van Zanten JJ，Metsios GS，et al.The end o the lium and its role in regulating vscular tone[J].Open Cardiovase Med J，2010，4：301-312.

[3]边宁，龚博君，郭军，等.一氧化氮/诱导型一氧化氮合酶在动脉粥样硬化过程中的作用[J].中国病理生理杂志，2014，33（3）：414-418.