超高效液相色谱串联质谱测定苹果中灭菌丹残留量

2018-03-05汤祝华梁晓涵王海灵王丹党政

热带农业科学 2018年12期

汤祝华梁晓涵王海灵王丹党政

摘要采用QuEChERS前处理方法联合超高效液相色谱一串联质谱（UPLC-MS/MS）检测，建立了苹果中灭菌丹残留量的检测方法。依据灭菌丹的化学性质特点优化了流动相组成和质谱条件，灭菌丹的检测线性范围5～200 ng/mL，回收率93.6%～102.3%，RSD 0.5%～7.3%。结果表明：该方法简便快速、结果准确，适用于苹果中灭菌丹残留量的测定。

关键词苹果;灭菌丹;超高效液相色谱串联质谱;稳定性

灭菌丹（folpet），化学名称N-三氯甲硫基邻苯二甲酰亚胺，是苯二甲酰亚胺的衍生物，属于三氯甲硫基类杀菌剂。作为广谱、高效的杀菌剂，灭菌丹可用于果树、蔬菜中多种病害的防治，其灭杀效果好、药害小，适当使用还有刺激植物生长的作用[1-2]，广泛用于农业生产中。但是，美国环境保护署（EPA）公布的已评估致癌可能性的农药中，灭菌丹属于可能的人类致癌物（c类）[3]。张业鹏[4]的DNA结合试验结果显示，灭菌丹或中间产物可以嵌插进DNA双螺旋中，柳云恩[5]等通过试验确定了95%灭菌丹原药对SD大鼠的毒性作用，并得出前胃为潜在的毒性靶器官。因此，各国都对灭菌丹在水果蔬菜中的残留量规定了最低的限量，我国现行标准GB 2763-2016[6]对苹果中灭菌丹的最大残留量规定为10 mg/kg。

灭菌丹的检测方法主要有薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法、气质联用法和液质联用法等[7-11]。目前，灭菌丹的国家标准检测方法通常用GB/T 20769-2008和GB/T 20770-2008，均為液质联用法[12-13]。QuEChERS （Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe），是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，2003年由美国农业部开发[14]。本文在GB/T20769的基础上，改用QuEChERS法为前处理，依据灭菌丹的化学性质特点优化了流动相组成和质谱条件，极大地提升了检验效率和检验结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备

Waters Vevo TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC-MS/MS）、IKA⑧T25均质器、Eppendorf5804R台式冷冻离心机、IKA振荡器、梅特勒精密天平（XS205D/CP225D）。

1.1.2 主要试剂及标准品

苹果（市售），丙酮（默克，色谱级），乙酸（默克，色谱级），甲酸（默克，色谱级），乙腈（默克，色谱级），水为超纯水，PSA（美国艾杰尔科技有限公司），氯化钠（广试，AR，用前150℃烘6 h），醋酸钠（广试，AR），无水硫酸镁（广试，AR，用前500℃马弗炉内烘6h），陶瓷均质子（Agilent公司）。

农药标准品：灭菌丹（99.0%，DR，Ehrenstorfer。

取灭菌丹对照品适量，用丙酮溶解，配制成浓度为1mg/mL的灭菌丹标准储备液，置于0～4℃避光贮藏。用乙腈配制浓度为1.0μg/mL标准中间液。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

准确称取10 g匀浆后的苹果样品置于50 mL离心管中，加入2粒陶瓷均质子，10mL乙酸乙腈溶液（1：99），涡旋振荡2min，置于-20℃冰箱冷冻20min，加入4g无水硫酸镁和1g醋酸钠，1g氯化钠，涡旋振荡2min，离心5min （4℃，5000 r/min），准确吸取6 mL上清液，放人事先装有400 mg PSA，1200 mg无水硫酸镁的15 mL离心管中，涡旋振荡2 min，置于冷冻离心机中离心5min（4℃，5 000 r/min），取上清液经0.22μm滤膜过滤，取滤液，待上机检测。

1.2.2 仪器条件

1.2.2.1 超高效液相条件

色谱柱AcQuity UPLC C18 （1.7μm， 2.1mm×50mm）;流动相乙腈（A）-流动相0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～0.5 min， 10%A;0.5～2.0min， 10%-75%A;2.0-4.0min，75%A;4.0～4.1 min， 75%～10%A;4.1～6.5 min，10% A）流速0.3 mL/min;柱温40℃;进样量1μL。

1.2.2.2 质谱条件

电离方式：电喷雾电离（ESIT）;扫描方式：多反应监测（WIRM）;毛细管电压3.0KV;离子源温度150℃;脱溶剂气氮气流量1000 L/Hr、温度400℃;锥孔气氮气流量150 L/Hr;碰撞气氩气流量0.15mL/min。灭菌丹离子信息见表1，灭菌丹离子图见图1。

2 结果与分析

2.1 灭菌丹溶液稳定性试验（配制溶剂：甲醇）

灭菌丹，室温下难溶解于水（1.0mg/L， 25℃），微溶于有机溶剂，纯品在干燥条件下较稳定，室温下遇水缓慢水解，遇高温或碱性物质迅速分解[15]。国标GB/T 20769-2008使用甲醇为溶剂配制标准溶液，但在实际检测工作中，连续监测了灭菌丹在甲醇中的响应值，检测结果见图2。实验结果显示，使用甲醇为溶剂配制的灭菌丹标准溶液以及样品溶液的响应值往往随着时间变化迅速降低。

2.2 灭菌丹配制溶剂的比较

使用多种溶剂配制灭菌丹标准溶液，通过在常温下（25℃）放置2h，24h检测其响应值变化来研究灭菌丹的稳定性，详见表2。

结果显示，使用不同溶剂配制的灭菌丹标准溶液仪器响应值有较大差异，甲醇、乙腈/水（10：90）V/V溶剂的响应值最低，乙腈及乙腈/0.1%甲酸水（60：40）V/V响应值较高。在2h以内，甲醇、乙腈/水（10：90） V/V溶剂中的灭菌丹不稳定。24 h时，各种溶剂中的灭菌丹都有不同程度的分解。可见灭菌丹在甲醇、水为主体的溶剂中稳定性很差，在乙腈为主体的溶剂中较为稳定。此外，pH对灭菌丹稳定性影响较大，添加甲酸可以提升灭菌丹的稳定性，这与文献报道的相一致[1]。但是，无论是调节pH还是使用乙腈作为溶剂，在放置较长时间后（24 h）仍比较容易分解。

2.3 方法学试验

用空白样品提取液配制2、5、10、30、50、80、100、200 ng/mL灭菌丹系列标准工作液进行测定。以峰面积A为纵坐标.浓度C （5～200 ng/mL）为横坐标进行回归分析，结果表明，当灭菌丹的浓度在5～200 ng/mL时，存在良好的线性关系。用不含灭菌丹的苹果样品进行标准添加试验（添加水平分别为5、10、100 mg/kg），结果详见表3。

2.4 脱溶剂温度的优化

因为灭菌丹是通过脱氯发生离子化，如图3所示。因此温度升高有利于灭菌丹脱氯，提高离子化效率。其他条件不变，分别在不同的脱溶剂温度下测定灭菌丹的响应值大小，结果如表4。实验结果表明灭菌丹在脱溶剂温度为400℃时响应值最高。

3 讨论与结论

从灭菌丹的稳定性实验可以看出，如果在前处理过程中花费的时间过长，或者提取过程中的溶剂不合适，灭菌丹就有可能发生降解。与QuEChERS方法相比，傳统前处理方法的过程步骤较多，在处理的样品数量比较大的情况下花费的时间较长，往往回收率很低。QuEChERS方法简单，整个前处理过程通常可以在1～2h完成，以乙酸酸化的乙腈作为提取溶剂，不仅提升了灭菌丹的稳定性，而且可以获得比较准确的结果。依据灭菌丹的化学性质特点优化了流动相组成和质谱条件，本文建立了苹果中灭菌丹残留量的检测方法，即QuEChERS前处理方法联合UPLC-MS/MS检测。本方法灵敏度高，定性定量准确，实验前处理简单快速，可有效地满足苹果中灭菌丹农药残留检测的要求，极大地提升了检验效率和检验结果的准确性，为相关国家标准的修订提供了可靠的技术支撑。

参考文献

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