磁珠富集法开发蕨麻SSR标记引物

富贵，李军乔，包锦渊，白世俊，韦梅琴(1.青海民族大学青藏高原蕨麻研究中心，青海 西宁810007；2.“青海省高原作物种质资源创新与利用”国家重点实验室培育基地，青海 西宁810016；3.青海省生物技术与分析测试重点实验室，青海 西宁810007；.青海大学农牧学院，青海 西宁810016)

蕨麻(Potentillaanserina)属蔷薇科(Rosaceae)委陵菜属(Potentilla)，青藏高原地区称之为人参果、 延寿果或蓬莱果等[1-2]，是一种典型的多年生草本植物，主要通过匍匐茎克隆繁殖。蕨麻分布地域辽阔，除我国北部如青海、西藏、新疆、甘肃、宁夏、内蒙古等地有分布以外；欧洲、南美洲西南部的智利及亚洲其他地区；北半球温带地区；位于大洋州的新西兰和塔斯马尼亚岛等地都有蕨麻分布[3]。

蕨麻根结构形态在不同温度或海拔地区表现出形态特征差异性，生长在海拔较高、温度较低的高原地区，其根会膨大形成棒状、球状、线结状等形态。这种膨大根富含淀粉、膳食纤维、蛋白质和多糖等营养成分，更富含人体所需要的各种维生素和微量元素，具有很好的营养和保健作用[4-5]，可当做食物直接食用，也可入药和用于保健品的加工，在当地被当做一种民俗食品而广泛推崇；近几年来国家对青藏高原地区生态环境保护特别重视，野生蕨麻栖息地广泛，其生态适应性广，尤其是河滩边，草甸等水分充足雨量较大的地区；蕨麻具有抗寒性强，耐干旱，喜阴湿，耐涝等生理特征；加之其茎呈莲座状，根系发达，长 7～18 cm，可防止水土流失，防风固沙，为保护青藏高原草原生态环境及生态恢复提供了有力的资源保障[3]。蕨麻属于野生资源，以前人们获取蕨麻鲜果的唯一方式是人工野外采挖，这不仅导致青藏高原地区草地严重破坏，而且造成了蕨麻野生资源的严重流失。所以大量培育并开发蕨麻栽培种显得尤为迫切，自青海民族大学青藏高原蕨麻研究中心通过引种、驯化、人工选育出了一系列蕨麻栽培种如蕨麻1号，蕨麻2号等品种以来，人工野外采挖规模极大缩减，不仅使野生蕨麻资源得到保护，而且推动了蕨麻的种植、产品加工的产业化。鉴于蕨麻具有很大的食用和药用开发价值，以及在青藏高原生态系统保护中的重要性，蕨麻相关育种、栽培工作还需进一步加强和推进。

目前对于蕨麻遗传学方面的研究甚少，课题组对于蕨麻细胞学研究发现，蕨麻具有四、五、六倍体3种倍性，其中主要以四倍体为主，蕨麻倍性复杂，对于不同倍性基因组之间的关系也不清楚[6]，这为蕨麻育种工作带来了极大的困难。分子标记技术被广泛应用于植物遗传研究中，虽然课题组已开发出了蕨麻AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)分子标记，并建立了PCR扩增体系，初步从分子水平探明了青藏高原蕨麻种质资源概况及分布，但是关于蕨麻SSR(Simple sequence repeat，简单重复序列)分子标记的研究还未曾报道。简单重复序列广泛分布在物种全基因组内、具共显性遗传特点、另外其具有扩增稳定、操作简单、结果多态性丰富等优点，而被广泛用于动植物种质资源遗传多样性分析、分子遗传图谱构建、基因定位、指纹图谱构建以及分子标记辅助育种等研究中[7]。目前SSR标记开发及应用分析已在许多植物上开展，如拟南芥(Arabidopsisthaliana)、小麦(Triticumaestivum) 、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、油菜(Brassicanapus)等[8-12]。磁珠富集法是一种原始，但简单、有效的植物SSR分子标记开发方法，其主要原理是，植物基因组酶切、后经PCR扩增，与含有生物素标记的特异性SSR序列探针杂交，然后用包被着链亲和素的磁珠，对含有生物素标记的探针进行磁力吸附，从而获得含有目标片段的重复序列[13]。本研究旨在利用磁珠富集法开发出对分析蕨麻有用的SSR引物，并分析其特点和通用性，以期丰富蕨麻分子标记技术类型，促进蕨麻基因组学研究，加快蕨麻育种进程。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究共选取12个具有明显地理分布差异的蕨麻样本用于SSR引物初步筛选验证，其中青海蕨麻2号用于开发蕨麻SSR引物，所有蕨麻参试材料均采自青海互助南门峡蕨麻种质资源圃，材料相关信息详见表1。每个材料分别取生长良好的同一植株新鲜嫩叶2～3片，装入已放有干燥硅胶的自封袋内，编号，带回实验室，待叶片完全干燥后放入-20 ℃冰箱保存。采样时间为2015年7月，实验时间为2016年1-3月。

表1 供试材料及原产地详细信息Table 1 Materials and detailed information of origins

1.2 DNA的提取

采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物技术有限公司，货号DN15)进行DNA提取，得到样品DNA溶液。

1.3 SSR序列富集

1.3.1基因组双酶切与接头连接 基因组用EcoRⅠ，Mse I 进行双酶切，酶切时间为3 h，酶切体系为50 μL，酶切体系包含DNA 1 μg、10×T4DNA ligase 5 μL、Buffer 5 μL、EcoRⅠ (10 U·μL-1)和MseI (10 U·μL-1)各1 μL、其余用双蒸水补齐，酶切完成后，沸水浴加热5 min失活，室温冷却后，利用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。连接体系为20 μL，含酶切产物7 μL，EcoRⅠ接头和MseI接头各75 pmol，接头序列分别为：5′CCTCGTAGACTGCGTACC 3′，5′TTAACCATGCGTCAG 3′；5′GACGATGAGTCCTGGC 3′，5′GGCGGTC CTGAGTA 3′、T4DNA ligase 1.5 U、10×T4DNA ligase Buffer 2 μL，其余用双蒸水补齐，4 ℃连接过夜。

1.3.2预扩增 PCR扩增体系共为20 μL，包含连接接头的模板DNA 2 μL、2×PCRmix 10 μL、E00(5′ GACTGCGTACCAATTC 3′)10 pmol、M00(5′GATGAGTCCTGAGCGG 3′)10 pmol、Taq酶0.2 U，其他用双蒸水补齐。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min后，94 ℃变性45 s；退火温度为50 ℃，时间为45 s；在72 ℃下延伸45 s、30次循环；72 ℃再延伸10 min后4 ℃冷藏保存。PCR 扩增产物利用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测分析。

1.3.3磁珠富集含有SSR位点的片段 1)平衡磁珠及杂交:参照MagneSphere Magnetic Separation Products(Promega)试剂盒操作说明书，拿出冷藏保存在4 ℃冰箱中的磁珠，轻轻混匀，以便使磁珠充分散开。利用磁架收集，静置约1 min，使所有磁珠吸附在管壁一侧。用微量移液器吸去管内液体。加入300 μL 0.5×SSC(saline sodium citrate，柠檬酸钠缓冲液)将磁珠清洗3次，清洗过程中每次都用磁架收集，缓缓移去清洗液后加入100 μL 0.5×SSC溶液使磁珠悬浮。将200 pmol用生物素标记的(AG)15、(GT)15探针加入100 μL PCR预扩增产物在沸水浴中高温变性5 min后，快速放置在冰上10 min后，加入2.5 μL 体积的20×SSC溶液，温度为62 ℃水浴锅中温浴30 min，取出后室温自然冷却。待冷却后的杂交混合液和已平衡好的磁珠混合均匀，室温下静置10 min，每隔2～3 min轻轻晃动一次，确保生物素能够完全吸附在包被有亲和素的磁珠上。

2)漂洗与洗脱:在室温下，利用磁架吸附磁珠，移液枪移走上清溶液，用0.1×SSC缓冲液清洗4次磁珠，每次SSC缓冲液用量为300 μL，最后一次清洗，用体积为300 μL 的0.08×SSC。加入100 μL灭过菌的ddH2O，缓慢摇动离心管以便使磁珠能够全部悬浮，在90 ℃温度下静置10 min，期间缓缓晃动2～3次，利用磁架吸附磁珠，然后收集上清溶液移入另一灭过菌的1.5 mL离心管内。在上清液内加入100 μL灭过菌的ddH2O，重复上述步骤。最后，收集的上清液加入200 μL灭过菌的ddH2O，在90℃下静置20 min，期间缓缓晃动3～5次，再次用磁架吸附磁珠，然后上清液被收集在另一个灭菌的1.5 mL离心管内，其收集液用于做对照试验。

3)PCR扩增:利用冷冻干燥机分别使两管体积为200 μL的回收产物浓缩至体积为20 μL，然后以其为模板再进行PCR扩增。反应体系如表2所示。

反应程序为：94 ℃下，变性时间为45 s，退火温度为50 ℃，时间为45 s，在72 ℃温度下延伸45 s，进行5次循环；最后，72 ℃下延伸10 min；扩增产物4 ℃下保存即可。取5 μL扩增产物利用1.5%的琼脂糖胶进行电泳检测，电泳条带为弥散状才可进行下一步试验。

1.3.4重组转化与克隆鉴定 PCR扩增产物纯化后冷冻干燥浓缩至体积约6 μL，浓缩后产物与pMD18-T(TaKaRa)载体进行连接，连接产物转化进入到感受态细胞E.coil中。涂布于含氨卞青霉素的LB培养皿上，倒置，于37 ℃下培养过夜。利用pMD18-T载体的通用扩增引物M13-47(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)或RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)各自与重复序列(AG)9所组成的双引物对AG富集文库菌落进行扩增筛选检测。取5 μL PCR产物利用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，对于能扩增出清晰电泳条带的菌落再进行质粒测序。

表2 PCR扩增反应体系Table 2 Reaction system of PCR amplification

1.3.5序列分析及SSR引物筛选 利用Chromas软件打开测序结果，对测序峰图进行检查，测序结果经手工校正，并挑选出包含有SSR位点的序列。利用DNAman软件删除载体和接头的序列，再用CodonCode Aligner软件对包含有SSR位点的序列进行比对分析，删除重复的序列后用引物设计软件Primers 5设计SSR引物。采用以下PCR的反应体系对设计的引物进行扩增检测，PCR的反应体系20 μL,包括模板DNA 25 ng、10×Buffer 2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL、10 μmol·L-1F-primer 0.25 μL、10 μmol·L-1R-primer 0.25 μL、5 U·μL-1Taq酶0.2 μL，其余用ddH2O补齐。SSR PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃(退火温度在54 ℃上下波动)复性，时间为35 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；最后72 ℃延伸3 min。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对初筛设计的引物进行复筛，检测样本数量为12，筛选多态性丰富、且条带清晰、可稳定扩增的引物，统计电泳检测结果，计算SSR引物相关参数，12个样本等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’ s 基因多样性指数(H)、Shannon’s 信息指数(I)都是在 Popgene32 1.32软件中完成；使用PIC Calc 0.6软件计算多态性信息含量(PIC)。

2 结果与分析

2.1 蕨麻基因组酶切及SSR位点富集

取片段大小合适的蕨麻DNA 目标片段为模板进行微卫星探针杂交，并通过 PCR 预扩增，有效放大基因组酶切片段，从而得到丰富的用于测序的富含简单重复序列的基因组片段，方法简便快捷。本研究中蕨麻全基因组经过EcoRⅠ 和MseⅠ双酶切后，酶切产物与接头连接并经PCR 预扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖电泳图检测，检测结果显示电泳条带成弥散状，对PCR预扩增产物进行SSR位点富集，获得短基因组片段大小分布在200～1000 bp之间(图1)，满足后续转化和克隆条件。

图1 磁珠富集获得的SSR短基因组 PCR电泳图Fig.1 PCR electrophoretogram of short genome by magnetic beads enrichment product 泳道1、2为富集产物 PCR 扩增电泳条带。1, 2: PCR electrophoresis results of enrichment products. M: 标记Marker.

2.2 目的片段阳性克隆筛选、测序及引物设计

以菌液为模板，特异性引物M13进行扩增。利用 PCR扩增法筛选单克隆。如果扩增得到电泳条带显示2条或2条以上的电泳条带，则表明克隆成功，共获得有效克隆236个(图2)，从阳性克隆中随机选出80个克隆进行测序。对所测序列结果通过DNAman软件进行比对分析，筛选出68条序列(85%)为特有序列，剩余的 12 条序列都是相同重复序列。通过SSRhunter软件分析查找68条序列中的简单重复序列位点，共扫描检测出SSR位点162个，选择具有SSR位点的序列共40条，参照Primer 5引物设计软件说明书操作步骤，总共设计出40对引物，引物序列送至上海生工生物工程股份有限公司，最终合成引物共40对。

图 2 阳性克隆筛选Fig.2 Screening positive clones M：标记Marker (100 bp DNA ladder).泳道 1、 2、 3为有效克隆。 Lane 1，2，3 were effective clone.

2.3 蕨麻微卫星特征分析

本实验最终获得的蕨麻SSR引物序列40对，编号依次为P1～P40(表3)，对40对引物序列分析发现，以CT和AG为重复单位的引物占最多，其中以CT为重复单位的引物14对(35%)，重复次数介于10～20之间7对，20对以上的3对，最大重复次数 32次；AG为重复单位的引物15对(37.5%)，重复次数介于10～20之间7对，20对以上的2对，最大重复次数23次。参考Weber对微卫星分类[14]，将所获得的微卫星序列分为3类，其中完全型微卫星34对(85%)，非完全型类型3对(7.5%)，复合型类型3对(7.5%)。没有观察到3碱基为单位的重复序列。

2.4 蕨麻SSR引物初步筛选及多态性分析

选取了12个地理分布差异较明显的蕨麻材料，提取基因组DNA，利用聚丙烯氨酰胺凝胶电泳进行检测，对40对引物进行了初步筛选，结果显示未扩增出条带的引物3对，17对引物条带不清晰或没有多态性，20对引物(P3、P5、P6、P7、P8、P12、P15、P18、P19、P21、P24、P25、P26、P27、P28、P30、P32、P31、P34、P40)可以扩增出清晰，稳定，且多态性丰富的电泳条带，扩增效率达50%，20对引物已上传至GenBank,登录号详见表4。对筛选出的20对引物扩增结果做了初步分析，筛选出的引物扩增出多态性位点总共为338个，平均每对引物扩增出17个多态性位点，引物P25所扩增出多态性位点最多，为29个，平均有效等位基因数(Ne)为1.244个；多态性信息含量(PIC)大小为0.8234～0.9570，变化范围较小，平均为0.8996；Nei’s 基因多样性指数(H)平均为0.1768，最高为0.2521，最低为0.1208；Shannon’s 信息指数(I)最高值为0.4020，最低为0.2332，平均为0.3078，各参数详见表4，部分材料微卫星引物多态性分析检测电泳图见图3。利用20对引物扩增结果对12份材料的亲缘关系进行了分析，12份材料UPGMA聚类分析结果表明：参试材料之间具有较为复杂的遗传关系(图 4)。

表3 开发出的蕨麻40条引物基本信息Table 3 Basic information of 40 developed primers for P. anserina

表 4 20对SSR 标记基于 12 份蕨麻材料的遗传多样性参数Table 4 Genetic diversity parameters based on 20 SSR markers in 12 P. anserina plants

图3 P1～P4引物筛选电泳图Fig.3 Electrophoretogram of P1-P4 primer screening

图4 基于SSR标记的12份材料聚类分析Fig.4 UPGMA dendrogram of twelve materials based on SSR markers1～12：所选用的蕨麻材料编号(详见表1)。1～12: Code of selected Potentilla anserina materials (see details in Table 1).

3 讨论

目前获得SSR分子标记引物的途径主要有以下几种，一是通过生物信息学的技术手段，在现有的大量生物共享数据库中如 NCBI、GeneBank及EST序列数据中搜寻与目标物种相关的SSR序列，该方法直接有效，但是已开发的物种相对较少，具有局限性[13]。也可利用已开发的近缘物种SSR序列进行扩增，需进行筛选，选择重复性较高，多态性丰富的引物。但是蕨麻分子生物学方面的研究较少，除课题组开发过其AFLP引物外，SSR分子标记开发研究还未有人涉及。传统杂交富集法，通过建立和筛选微卫星富集文库，提高了克隆效率，是一种有效的经典的方法。

本研究通过磁珠富集法最终获得蕨麻SSR有效序列80条，设计出可扩增SSR引物40对，分离效率为50%，比常规开发阳性分离率(2%～3%)[15]高出很多，具有多态性引物筛选出共20对，多态性引物占总开发引物50%。前人研究发现利用磁珠富集法可以极大地增加获得SSR阳性克隆的概率，阳性克隆获得率可以增加至50%～60%[16]。本研究所获得的阳性克隆率比其他常见植物较高，与上述观点较一致。如李炟等[17]研究马尾松(Pinusmassoniana)的实验结果为13.8%；邓欣等[13]建立的用生物素包被的Dynal磁珠富集分离亚麻(Linumusitatissimum)微卫星分子标记方法，得到的 CT插入文库中微卫星的阳性克隆率>22.99%；薛华柏等[18]在开发分离小黄李(Prunussalicina)基因组微卫星试验中也使用了磁珠富集法，实验结果显示：获得了31个阳性克隆，随机选择18个克隆进行测序，测序结果对比分析，最后获得12 条包含SSR位点的特异序列。不同植物实验材料间阳性克隆率差异可能和基因组结构差异有关。虽然利用生物信息学和转录组测序已成为SSR引物标记开发的有效手段，但传统的杂交富集法为蕨麻SSR标记开发提供了有效的途径。本研究所获得的蕨麻SSR引物主要以完全型为主，完全型占到了85%，非完全型和复合型所占比例较低(15%)，重复单位以CT和AG为主，这和其他植物研究结果一致，如王艳红等[19]利用杂交富集研究菠萝蜜(Artocarpusheterophyllus)SSR标记结果表明完美型引物占87.5%，重复单位也主要是CT和AG; 胡磊等[20]用相同方法研究花榈木(Ormosiahenryi)所获得的微卫星序列中以完美型为主，有 21 个，占整个微卫星序列的87.5%，非完美型与混合型较少，重复碱基数以双核苷酸居多，其中以(GA)n/(CT)n 最多。Weber[14]研究表明，SSR序列中2碱基重复序列的重复频数，如果超过12 次，该SSR标记具有较高多态性信息含量 (PIC，polymorphic information content)值的可能性增加。Orit 等[21]也认为当重复次数大于等于16 时，SSR标记PIC值大于0.5时可以进行相应的多态性分析。本研究所获得的蕨麻微卫星序列重复数在 12 次以上的有 23 个，占总数的67.5%。重复次数高的序列占大多数，提高了获得多态性微卫星分子标记的概率。而且Smulders 等[22]认为重复序列重复频数较高的微卫星在分析物种遗传多样性时更有效，因为重复次数高时才可在不同种间产生多态性，种内多态性位点也能被检测到，但重复次数少的微卫星具有局限性，只能在种间检测出多态性位点。

本研究首次开发出了蕨麻SSR微卫星引物40条，初步筛选得到20条扩增稳定且多态性丰富的引物，20对引物扩增结果揭示出蕨麻参试材料的遗传多样性水平较高[23]；PIC指数也常常被用于揭示遗传基因的变异程度，Botstein等[24]所提出的标准认为：若PIC<0.25 时，多态性位点较低，PIC介于0.25～0.50 时，多态性位点属于中度丰富，而PIC大于0.50 时，则说明该位点具有丰富的多态性。本实验所得到20对引物多态性信息含量为0.8996，揭示出所筛选到的20对蕨麻引物多态性丰富，在蕨麻种群内通用性较高。本研究中12份材料聚类结果比较复杂，聚类结果并没有与其资源分布相对应，如材料9和材料10地理分布相差很大，但却显示亲缘关系较近，这一结果可能与蕨麻克隆生殖的特殊繁殖方式有关；另外，本研究旨在开发和分析蕨麻SSR引物与其特征，所以每个地区随机选取参试材料只有一个，聚类结果虽然并不能充分解释不同地区蕨麻的亲缘关系，但为下一步揭示青藏高原地区蕨麻遗传多样性可行性奠定了基础。近几年来，关于利用SSR分子标记进行物种遗传多样性分析，连锁图谱、指纹图谱构建的研究多有报道。如徐军等[25]利用SSR分子标记构建了烟草(Nicotianatabacum)核心种质中80份普通烟草种质的指纹图谱。张金华等[26]利用磁珠富集法开发出有效的SSR分子标记并分析了蒙古绣线菊(Spiraeamongolica)和高山绣线菊(Spiraeamongolica)群体遗传结构。姜志艳等[27]利用SSR分子标记构建了四倍体杂交冰草(Agropyroncristatum)的遗传连锁图谱。所以本研究所获得的20对蕨麻SSR标记可用于后续筛选多态性丰富、遗传信息含量高的分子标记、蕨麻种质资源遗传多样性分析、青藏高原蕨麻群体遗传结构分析和品种指纹图谱的构建等相关研究中。

4 结论

本研究选取了青海蕨麻2号为材料，利用磁珠富集法开发出蕨麻SSR有效序列80条，设计出可扩增SSR引物40对，分离效率为50%，比常规开发阳性分离率高出很多；为了验证40对引物的适用性，选取了主要来自青藏高原范围内12份蕨麻材料，利用聚丙烯氨酰胺凝胶电泳进行检测，对40对引物进行了初步筛选，20对引物(P3、P5、P6、P7、P8、P12、P15、P18、P19、P21、P24、P25、P26、P27、P28、P30、P32、P31、P34、P40)可以扩增出清晰，稳定，且多态性丰富的电泳条带，扩增效率达50%；20对引物扩增结果分析显示，扩增出的多态性位点共338个，平均每对引物扩增出17个；平均有效等位基因数(Ne，1.244)，Nei’s基因多样性指数(H，0.1768)和Shannon’s 信息指数(I，0.3078)揭示出蕨麻参试材料的遗传多样性水平较高；本实验开发出20对蕨麻SSR引物多态性信息含量(PIC)为0.8996，说明筛选到的20对引物具丰富的多态性，在蕨麻种群内通用性较高；12份材料聚类结果表明来自不同地区的蕨麻亲缘关系较为复杂，不能完全与其分布区域相对应。20对SSR引物为蕨麻遗传变异研究提供了新的分子标记工具，可用于后续蕨麻种质资源开发利用、遗传多样性分析、青藏高原蕨麻群体遗传结构分析和品种指纹图谱构建等相关研究中。

References：

[1] Northwest Institute Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences. Economic Flora of Qinghai. Xining: Qinghai People’s Publishing House, 1987: 270-271.

中国科学院西北高原生物研究所. 青海经济植物志. 西宁: 青海人民出版社, 1987: 270-273.

[2] Jiangxi Medical College. Dictionary of Medicinal Plant: Volume Two. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 1997.

江西新医学院. 中药大词典: 下册. 上海: 上海人民出版社, 1997.

[3] Li J Q. The exploiture and utilization of wild resources foliagePotentillaanserineL. Journal of Biology， 2003, 20(5): 34-36.

李军乔. 青海省野生资源植物—鹅绒萎陵菜的应用研究. 生物学杂志, 2003, 20(5): 34-36.

[4] Wang F, Lu J X, Shen X R,etal. Determination of nutritional ingredients ofPotentillaanserine. Food & Drug, 2007, 9(7): 33-34.

王峰, 卢建雄, 申晓蓉, 等. 蕨麻营养成分测定. 食品与药品, 2007， 9(7): 33-34.

[5] Sun J, Lü J P, Bo H B. Analysis and evaluation of dietetic nutrimental ofPotentillaanserinaroots. Food Science, 2008, 29(2): 411-414.

孙洁, 吕加平, 薄海波. 藏药蕨麻的营养成分分析及评价. 食品科学, 2008, 29(2): 411-414.

[6] Li J Q, Jiang H X, Wen X,etal. Karyotype analysis of sextuploid juema. Hubei Agricultural Sciences, 2014, 53(11): 2569-2572.

李军乔, 蒋红霞, 温馨, 等. 六倍体蕨麻的核型分析. 湖北农业科学, 2014, 53(11): 2569-2572.

[7] Chen M L, Wu J, Wang L F,etal. Development of mapped simple sequence repeat markers from common bean (PhaseolusvulgarisL.) based on genome sequences of a Chinese landrace and diversity evaluation. Molecular Breeding, 2014, 38(3): 489-496.

[8] Zhang Y Y, Fang Z Y, Wang Q B,etal. Utility of arabidopsis chloroplast simple sequence repeat (cpSSR) primers in cabbage (BrassicaoleraceaL. var.capitataL.). Acta Horticulturae Sinica, 2011, 38(3): 549-555.

张扬勇, 方智远, 王庆彪, 等. 拟南芥叶绿体 SSR 引物在甘蓝上的应用. 园艺学报, 2011, 38(3): 549-555.

[9] Röder M S, Korzun V, Wendehake K,etal. A microsatellite map of wheat. Genetics, 1998, 149(4): 2007-2023.

[10] Natalya Sharopova, Michael D, McMullen,etal. Development and mapping of SSR markers for maize. Plant Molecular Biology, 2002, 48(5/6): 463-481.

[11] Temnykh S, Park W D, Ayres N,etal. Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice (OryzasativaL.). Theoretical and Applied Genetics, 2000, 100(5): 697-712.

[12] Li X B, Zhang M L, Cui H R. Analysis of SSR information in EST resource of oilseed rape. Chinese Journal of Oil Crop Sciences, 2007, 29(1): 20-25.

李小白, 张明龙, 崔海瑞. 油菜EST资源的SSR信息分析. 中国油料作物学报, 2007, 29(1): 20-25.

[13] Deng X, Chen X B, Long S H,etal. Microsatellite molecular marker enrichment by magnetic beads in Flax. Acta Agronomica Sinica, 2008, 34(12): 2099-2105.

邓欣, 陈信波, 龙松华, 等. 用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记. 作物学报, 2008, 34(12): 2099-2105.

[14] Weber J L. Informativeness of human (dC-dA)n·(dG-dT)n polymorphisms. Genomics, 1990, 7(4): 524-530.

[15] Zhang Z C, Hou X L. Strategies for development of SSR molecular markers. Hereditas (Beijing), 2004, 26(5): 763-768.

张增翠, 侯喜林. SSR分子标记开发策略及评价. 遗传, 2004, 26(5): 763-768.

[16] Zane L, Bargelloni L, Patarnello T．Strategies for microsatellite isolation: a review．Molecular Ecology, 2002, 11(1): 1-16．

[17] Li D, Ji K S, Gong J. Microsatellite enrichment by magnetic beads inPinusmassoniana. Molecular Plant Breeding, 2007, 5(1): 141-144.

李炟, 季孔庶, 龚佳. 磁珠富集法筛选马尾松微卫星标记. 分子植物育种, 2007, 5(1): 141-144.

[18] Xue H B, Qiao Y S, Xu K Y,etal. DNA fragment isolation of genomic microsatellite inPrunussalicinaby magnesphere. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2006, 26(7): 1320-1325.

薛华柏, 乔玉山, 许宽勇, 等. 磁珠富集法分离小黄李基因组微卫星 DNA 片段. 西北植物学报, 2006, 26(7): 1320-1325.

[19] Wang Y H, Li Y Z, Feng F,etal. Isolation of microsatellite in jackfruit (Artocarpusheterophyllus) by magnetic beads. Journal of Fruit Science, 2010, 27(6): 1046-1051.

王艳红, 李映志, 丰锋, 等. 磁珠富集法分离菠萝蜜(Artocarpusheterophyllus)微卫星标记及系列分析. 果树学报, 2010, 27(6): 1046-1051.

[20] Hu L, Gao L, Yang B. Development of microsatellite primers inOrmosiahenryiby magnetic beads enrichment. Journal of Huazhong Agricultural University, 2010, 29(5): 629-633.

胡磊, 高丽, 杨波. 利用磁珠富集法开发花榈木微卫星引物. 华中农业大学学报, 2010, 29(5): 629-633.

[21] Orit G, Pearse D E, Avise J. Phylogenetic assessment of length variation at a microsatellite locus. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1997, 94(20): 745-749.

[22] Smulders M J M, Bredemeijer G, Rus-Kortekaas W,etal. Use of short microsatellites from database sequences to generate polymorphisms amongLycopersiconesculentumcultivars and accessions of otherLycopersiconspecies. Theoretical and Applied Genetics, 1997, 94(2): 264-272.

[23] Chen L Q, Shi S L. Genetic diversity of 42 alfalfa accessions revealed by SSR markers. Pratacultural Science, 2015, 32(3): 372-381.

陈立强, 师尚礼. 42份紫花苜蓿种质资源遗传多样性的SSR分析. 草业科学, 2015, 32(3): 372-381.

[24] Botstein D, White R L, Skolnick M,etal. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics, 1980, 32(3): 314.

[25] Xu J, Liu Y H, Ren M,etal. SSR fingerprint map analysis of tobacco germplasms. Chinese Tobacco Science, 2011, 32(2): 62-65.

徐军, 刘艳华, 任民, 等. 普通烟草种质资源的SSR标记与指纹图谱分析. 中国烟草科学, 2011, 32(2): 62-65.

[26] Zhang J H, Khan G, Fu P C,etal. Isolation and screening of molecular genetic marker SSR in Spiraea based on magnetic beads enriched. Journal of Biology, 2014, 31(3): 79-83.

张金华, Khan Gulzar, 付鹏程, 等. 基于磁珠富集法的绣线菊 SSR 分子标记分离与筛选. 生物学杂志, 2014, 31(3): 79-83.

[27] Jiang Z Y, Yu X X, Yu Z,etal. Construction of a genetic linkage map for tetraploid hybrid wheatgrass using a SSR molecular marker. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(6): 94-101.

姜志艳, 于肖夏, 于卓, 等. 利用SSR分子标记构建四倍体杂交冰草的遗传连锁图谱. 草业学报, 2016, 25(6): 94-101.