五指山小型猪不同器官内猪内源性反转录病毒的存在与表达

范瑞，贾俊婷，钟亚迪，马丽敏，冯书堂，马玉媛，章金刚

1.广西医科大学，广西 南宁 530021；2.军事科学院 军事医学研究院 卫生勤务与血液研究所，北京 100850；3.北京市盖兰德生物科技有限公司，北京 100007

异种移植为缓解临床同种供体移植物短缺问题提供了一种有效的方法。猪在解剖结构、生理特征、营养和新陈代谢等方面与人非常相似，因此被认为是最适合于异种移植的供体。然而异种移植仍然存在动物源性产品向人类传播病原体的潜在风险，其中猪内源性反转录病毒（por⁃cine endogenous retrovirus，PERV）可整合在所有猪种基因组中[1]，且已被证实在体外能够感染人源细胞[2]，因此被认为是猪细胞、组织或器官移植中最重要的病原体。虽然迄今没有证据表明在接受猪异种移植的非人灵长类动物或人类患者中存在PERV感染[3]，但全面监测PERV在不同器官内的分布和表达仍十分必要。国外科学家已对大白猪（Large-white pig）、尤克坦小型猪（Yu⁃catan micropig）等猪种不同器官中PERV的存在与表达情况进行了探索，但对中国特有小型猪的研究鲜有报道。

五指山小型猪是中国特有小型猪的一种。它具有体型小、性成熟早、产仔率高等优点，且该近交系连续近亲交配达到20代以上，近交系数大于99%，基因纯合度高，遗传稳定，可有效消除异种移植中种群繁殖的大多数病原体[4]，有望为异种移植提供合适供体。我们前期研究已发现五指山小型猪具有PERV基因序列拷贝数较低[5]，且无PERV-C亚型等特点[6]。本实验中我们将通过分析五指山小型猪不同器官内基因组DNA（ge⁃nomic DNA，gDNA）、mRNA中PERV的存在与表达情况，为猪-人异种移植器官选择积累重要的基础性数据。

1 材料和方法

1.1 材料

五指山小型猪近交系4头，来源于北京市盖兰德生物科技有限公司，各取其心、肝、脾、肺、肾、胸腺标本迅速置于液氮中保存。

基因组DNA纯化试剂盒购自Promage公司；RealMasterMix（SYBR Green）购自Tiangen公司；实时荧光定量PCR仪iQ5购自Bio-Rad公司；紫外分光光度计DU-640购自Beckman公司。

1.2 gDNA和总RNA提取

从液氮中取出冻存标本，在用液氮冷却的研钵中研磨成粉末状，用gDNA纯化试剂盒提取五指山猪各器官的gDNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。最终得到的各器官gDNA用紫外分光光度计测量浓度和纯度，储存于-20℃备用。

用TRIzol法从研磨成粉末状的标本中提取各器官的总RNA，用紫外分光光度计测量总RNA浓度和纯度，储存于-80℃保存备用。

1.3 反转录合成cDNA第一条链

以细胞总RNA为模板进行反转录，采用20 μL 体系［9 μL 细胞总 RNA，1 μL Oligo（dt）15，4 μL AMV 5×缓冲液，4 μL 10 mmol/L dNTPs混合物，20 U RNasin，12 U AMV反转录酶］，室温放置10 min后42℃水浴1 h，在AMV反转录酶的作用下反转录合成cDNA第一条链。

1.4 PCR及RT-PCR检测PERV的存在与表达

分别以4头猪不同器官的gDNA和cDNA为模板,用本室前期建立的PERV核酸检测方法[7-8]，对PERV结构基因gag、pol、env进行PCR扩增，预期扩增片段大小分别为361、150和265 bp。

50 μL PCR 体系包括约 100 ng gDNA，10×PCR 缓冲液 5 μL，10 mmol/L dNTPs混合物 4 μL，上、下游引物各 10 pmol，rTaqDNA 聚合酶2.5 U，加无菌去离子水至50 μL。扩增程序：94℃变性 5 min；94℃ 30 s，55℃（gag）/57℃（pol）/58℃（env） 45 s，72℃ 30 s，循环 30次；72℃延伸5 min。以五指山猪PBMC的gDNA或cDNA为阳性对照，以无模板为阴性对照（negative control，NTC）。

1.5 不同器官中PERV-pol表达的相对定量分析

1.5.1 标准品质粒的制备 根据本室前期测定的五指山猪来源的PERV基因序列（GenBank登录号EF133960.1）和GenBank数据库中检索到的β-ac⁃tin序列（GenBank登录号 AY550069），按照 qPCR引物设计原则，设计PERV-pol基因和内参基因β-actin的引物（表1），以五指山小型猪gDNA为模板进行PCR扩增。50 μL PCR体系包括约100 ng gDNA，10×PCR 缓冲液 5 μL，10 mmol/L dNTPs混合 物 4 μL，上 、下游引 物各 10 pmol，rTaqDNA聚合酶2.5 U，加无菌去离子水至50 μL。PCR扩增程序：94℃变性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，68℃ 30 s，循环 42 次；72℃延伸 5 min，同时设立无模板为NTC。将回收纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接、转化，得到重组质粒（pMD18-T-PERV-pol，pMD18-T-β-actin），用质粒提取试剂盒提取重组质粒后酶切鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒送中美泰和生物技术有限公司进行序列测定。用紫外分光光度计准确测定浓度后，根据下式计算其拷贝数，进行1/10梯度稀释，作为标准品保存于-20℃备用。

1.5.2 PERV-pol、β-actin标准曲线的建立 分别以1/10梯度稀释的标准品质粒pMD18-T-PERV-pol、pMD18-T-β-actin为模板进行 qPCR，采用 20 μL 反应体系，包括 RealMasterMix（SYBR Green）9 μL，模板1 μL，上、下游引物各 6 pmol，加无菌去离子水至20 μL。PCR扩增程序：94℃变性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，68℃ 30 s，循 环 42次；read plates，72℃延伸5 min。用起始模板拷贝数的10倍对每个稀释标准品的Cq值做图，得到PERV-pol及β-actin的标准曲线。

1.5.3 各器官中PERV-pol相对表达量的检测 分别以4头猪不同器官的cDNA为模板（浓度5～100 ng/μL，浓度＞100 ng/μL的样品须稀释），对PERV-pol、β-actin基因进行qPCR，反应体系及条件同1.5.2，每个样品设2个复孔，同时设立NTC。采用双标曲线法，目的基因PERV-pol表达值除以内参基因β-actin表达值为单细胞中PERV-pol的相对表达量，并计算各器官相对于心的表达量。

1.6 统计学分析

实验结果利用Excel软件和SPSS 17.0软件进行统计学分析，采用单因素多水平假设检验，进行正态性检验、方差齐性检验与秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 实时荧光定量PCR检测PERV的引物

2 结果

2.1 PCR及RT-PCR检测结果

分别以4头猪不同器官的gDNA和cDNA为模板，PCR及RT-PCR方法对PERV结构基因gag、pol、env进行检测，同时设立阳性对照及NTC。所得产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果表明样品均扩增出清晰条带，且片段大小与预期相符。图1～3为1号猪心、肝、脾、肺、肾、胸腺的gDNA扩增PERV的3种结构基因的电泳图。

2.2 PERV-pol、β-actin标准曲线的建立

图1 PCR检测PERV-gag基因

图2 PCR检测PERV-pol基因

图3 PCR检测PERV-env基因

分别以 8.25×108～8.25×104拷贝/μL 梯度稀释的 PERV-pol标准品质粒和 1.62×108～1.62×103拷贝/μL梯度稀释的β-actin标准品质粒为模板进行qPCR。标准品扩增曲线均呈典型的S形，在反应结束前进入平台期；标准品熔解曲线为单峰，Tm值分别为 83.2～83.6℃、82.0～82.4℃。PERV-pol标准曲线方程为y=38.77-3.46x，相关系数r=-0.997（图4）；β-actin标准曲线方程为y=33.12-3.12x，相关系数r=-0.998（图5）。

2.3 各器官中PERV-pol的相对表达量

分别以4头猪不同器官的cDNA为模板，用qPCR检测PERV-pol、β-actin基因的表达情况。样品曲线均在循环结束前进入平台期（图6）。肝、脾、肺、肾、胸腺相对于心的相对表达量分别为72.8%、98.2%、126.4%、81.8%、81.5%（图7）。经统计学分析，PERV-pol在各器官中的相对表达量不存在显著差异（P=0.310＞0.05）。

3 讨论

PERV是单股正链RNA病毒，属C型反转录病毒属,全长 8.1～8.9 kb。它由 5′非编码区、核心蛋白基因（gag）、聚合酶基因（pol）、囊膜基因（env）及3′非编码区组成[9]，以前病毒的形式整合在宿主基因组中。PCR及RT-PCR结果表明，五指山小型猪不同器官gDNA和cDNA中均能检测到PERV的存在与表达，与国外早期报道结果一致[10]。这说明PERV在猪生长发育早期就已整合在宿主基因组中，并随宿主基因的复制而复制并表达。

PERV-pol基因可编码病毒复制所需的反转录酶、整合酶、蛋白酶等，是影响病毒复制最重要的结构基因[11]，因此我们对各器官mRNA中pol基因的表达情况进行了相对定量检测，结果表明不同器官内pol基因的相对表达量不存在显著性差异。我们的研究结果与国外报道存在一些差异，Clemenceau等[12]通过半定量RT-PCR方法对大白猪不同器官中PERV的3种结构基因进行了检测，结果均显示在肾、肝中表达量最高，在胸腺、淋巴结中表达量中等，在胰脏中表达量最低；Bitt⁃mann等[13]发现尤克坦小型猪mRNA中PERV-pol基因在脾和肺中表达量最高。这些差异主要与猪的品系、遗传特征、年龄因素、暴露条件、样本数量等有关[14]，其次也可能与检测方法、引物设计、PCR敏感性不同有关[15]。

图4 PERV-pol标准曲线

图5 β-actin标准曲线

图6 cDNA样品扩增曲线

图7 不同器官cDNA中PERV的相对表达量

总之，我们用PCR、RT-PCR及RT-qPCR技术检测了PERV在五指山小型猪心、肝、脾、肺、肾、胸腺等6种器官中的存在与表达情况。这为异种移植提供了重要的基础性数据，对其病原安全性评价具有重要意义，也有利于我国特有小型猪资源的开发利用。

[1] Specke V,Rubant S,Denner J.Productive infection of human primary cells and cell lines with porcine en⁃dogenous retroviruses[J].Virology,2001,285(2):177-180.

[2] Patience C,Takeuchi Y,Weiss R A.Infection man cells by an endogenous retrovirus of pigs[J].Nat Med,1997,3:282-286.

[3] Specke V,Schuurman H J,Plesker R,et al.Virus safety in xenotransplantation:f i rst exploratory in vivo studies in small laboratory animals and non-human primates[J].Transpl Immunol,2002,9(2-4):281-288.

[4] Sypniewski D,Machnik G,Mazurek U,et al.Distribu⁃tion of porcine endogenous retroviruses(PERVs)DNA in organs of a domestic pig[J].Ann Transplant,2005,10(2):46-51.

[5] Ma Y Y,Yang Y X,Lv M M,et al.Real-time quan⁃titative PCR with SYBR Green I detection for estimat⁃ing copy numbers ofporcine endogenousretrovirus from Chinese miniature pigs[J].Transplant Proc,2010,42(5):1949-1952.

[6] Wu J M,Ma Y Y,Lv M M,et al.Large-scale sur⁃vey of porcine endogenous retrovirus in Chinese minia⁃ture pigs[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2008,31(4):367-371.

[7] Akiyoshi D E,Denaro M,Zhu H,et al.Identif i cation of a full-length cDNA for an endogenous retrovirus of miniature swine[J].J Virol,1998,72(5):4503-4507.

[8] Martignat L,Sai P,Jestin A.Detection of porcine en⁃dogenous retrovirus:possible involvement in pig islet xenotransplantation[J].Diab Metab,1998,24(5):434-441.

[9] 章金刚.猪内源性反转录病毒的某些分子生物学特性[J].中国人畜共患病杂志,2003,19(1):116-118.

[10]Yoon J K,Choi J,Lee H J,et al.Distribution of por⁃cine endogenous retrovirus in different organs of the hybrid of a Landrace and a Jeju domestic pig in Ko⁃rea[J].Transplant Proc,2015,47(6):2067-2071.

[11]孙宇,马玉媛,罗佳,等.应用RNA干扰沉默猪内源性反转录病毒[J].生物技术通讯,2013,23(1):52-55.

[12]Clemenceau B,Lalain S,Martignat L,et al.Porcine endogenous retroviral mRNAs in pancreas and a pan⁃el of tissues from specif i c pathogen-free pigs[J].Diabe⁃tes Metab,1999,25:518-525.

[13]Mazurek U,Kimsa M C,Strzalka-Mrozik B,et al.Quantitative analysis of porcine endogenous retrovirus⁃es in different organs of transgenic pigs generated for xenotransplantation[J].Curr Microbiol,2013,67(4):505-514.

[14]Zhang P,Yu P,Wang W,et al.An effective method forthequantitativedetection ofporcineendogenous retrovirus in pig tissues[J].In Vitro Cell Dev Biol An⁃im,2010,46(5):408-410.

[15]Joachim D.How active are porcine endogenous retrovi⁃ruses(PERVs)[J]?Viruses,2016,8(8):215.