三氧化二砷与组蛋白修饰模式的作用研究进展

张新宇，陈 鹏，陶宣辰

哈尔滨医科大学附属第二临床医院普通外科，黑龙江 哈尔滨 150081

表观遗传学就是通过改变非基因序列从而使基因表达水平发生改变[1]，主要通过组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化等修饰模式的改变来发挥作用[2]，在肿瘤的发病机制研究及治疗领域、表观遗传学的研究扮演着极其重要的角色。自其被应用于治疗白血病[3]，三氧化二砷治疗疾病的作用才被重视和挖掘，并开始推广其应用于抗肿瘤、化疗等[4]，但目前具体机制尚不明确，有待进一步研究。三氧化二砷摄入人体后，主要代谢的部位在肝脏，在5′-甲基化转移酶的作用下，形成了一甲胂酸(MMOL/LA)或二甲胂酸(DMA)而被解毒[5]。在自然界中砷剂虽有三价和五价两种形式，三价毒性高于五价，但砷剂对细胞的毒性主要看细胞对砷剂的摄入量和积累量[6]。哺乳动物三价砷剂主要通过细胞膜上水通道及上皮细胞葡萄糖转运体来吸收，所以三价砷剂是细胞毒性的主要参与者[7]。现阶段多数国内外学者在细胞分子生物及表观遗传学中对三氧化二砷的抗肿瘤机制的研究主要集中在组蛋白的乙酰化、甲基化、磷酸化修饰上。

1 三氧化二砷与组蛋白乙酰化修饰模式的改变

1.1组蛋白乙酰化修饰对基因表达的调控作用组蛋白的乙酰化修饰在哺乳动物的基因表达调控中发挥重要作用，其中组蛋白乙酰化修饰的水平主要是通过乙酰化转移酶和去乙酰化转移酶相互作用来维持及调控的，研究[8-9]证明乙酰化转移酶起主要作用。大量实验研究表明，利用控制变量分层研究方法，利用染色质免疫沉淀技术(CHIP)、流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)、凝胶电泳(Gel electrophoresis)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或免疫印迹等证实在乙酰化转移酶的作用下组蛋白乙酰化水平增强，而基因的表达活性也相应增强，组蛋白乙酰化水平的改变直接影响染色质空间结构，进而影响着基因启动子的表达及转录的开始[10-11]。这对于抑癌基因的启动相当乐观。

1.2三氧化二砷对细胞增殖的影响当三氧化二砷在世界范围内被当作一种有害物质时，20世纪70年代，我国学者首次应用其与全反式维A酸治疗M3型白血病取得了显著疗效，至此，这个致癌物药理价值及其相关机制才被医学研究员们发现，从而进行了大量的相关研究。国内外学者经过大量体内外实验研究发现，经三氧化二砷处理后的相应细胞的增殖较对照组被明显抑制，同时还证明抑制的程度随三氧化二砷的浓度的提高而趋于升高[12]。相关实验[13]还证明，三氧化二砷直接参与了细胞的凋亡过程，且不只参与一个细胞信号的传导通路，但具体作用机制尚不明确。

1.3三氧化二砷与组蛋白乙酰化修饰的相互作用通过细胞实验及生化分子实验，利用染色质免疫沉淀技术(CHIP)、流式细胞术(FCM)等证明[13]，三氧化二砷能够增强抑癌基因的表达，抑制细胞增殖、促进肿瘤细胞的凋亡[14-15]，在表观遗传学中缺乏相关机制研究。最近研究[16]表明，三氧化二砷对细胞内相应组蛋白表达水平的降低，很大程度是由于砷原子与组蛋白乙酰转移酶(HAT)hMOF之间的直接结合所导致的hMOF酶活性缺失造成的。通过体外对组蛋白乙酰转移酶活性的检测(HAT assay)证明，三氧化二砷直接抑制hMOF的酶活性。为了证明二者的相互作用机制，利用氨基苯基氧化砷(PAPAO)与琼脂糖凝胶树脂交联技术，构建出As-亲和树脂(As-activated agarose)，利用As-亲和沉淀实验证明，砷原子能直接结合hMOF。同时，采用MAIDI-TOF质谱检测和紫外光谱吸收的实验证明，砷原子直接结合在hMOF锌指结构的C2HC部位。实验[17]结果证明，三氧化二砷直接作用乙酰化转移酶的锌指结构上降低其活性，同时乙酰化转移酶反作用三氧化二砷，降低三氧化二砷对组蛋白对应基因表达，降低其毒性。三氧化二砷对乙酰化转移酶的作用力强于乙酰化转移酶对三氧化二砷的作用力。三氧化二砷升高去乙酰化转移酶的表达，但此作用并不能阻止三氧化二砷降低对应基因表达，同时去乙酰化转移酶并不是直接影响乙酰化转移酶的表达，而是间接影响。本实验优点：上述的实验结论不涉及去乙化转移酶的误差影响，同时阐明了组蛋白乙酰修饰模式的改变与三氧化二砷的两者相互作用，为以后探究两者的其他相互作用提供了依据，实验缺点：应该证明三氧化二砷是否也是直接作用去乙酰化转移酶上而出现上述结论，同时缺少证明乙酰化转移酶对三氧化二砷的反作用与三氧化二砷对去乙酰化转移酶的作用是否相关。

2 三氧化二砷与组蛋白甲基化修饰模式的改变

2.1组蛋白甲基化修饰对基因表达调控的作用在表观遗传中组蛋白的修饰所引起染色质结构的变化，在哺乳动物的基因表达调控中发挥着重要的作用[18]，其中组蛋白甲基化修饰尤为重要。学者们利用RT-PCR、亚硫酸氢盐PCR测序(bisulfite-sequencing PCR, BSP)、染色质免疫共沉淀(ChIP)等实验技术，进行相关生化及细胞学实验[19]证明，经过甲基化转移酶处理的对应组蛋白的表达增强，而其中主要的原因是组蛋白不同修饰模式通过改变组蛋白与DNA的结合，使染色质的空间结构改变，进而改变其他转录因子和基因启动子的亲和性来调控基因，上述结果的出现是因为组蛋白的甲基化修饰改变了染色质的结构，使染色质变得松散而出现控制基因表达的相关基因的活性增强，从而增强了组蛋白的表达，促进细胞的增殖。同时大量的实验研究[20]证明，抑癌基因的启动子对应组蛋白的甲基化导致转录失活在表观遗传学中同时也是一个可逆过程，通过改变基因的高甲基化状态,进而改变基因组表达，是去甲基化治疗的理论基础[21]。

2.2三氧化二砷与组蛋白甲基化修饰模式的相互作用三氧化二砷的抗癌作用在表观遗传学中不仅表现在三氧化二砷对组蛋白乙酰化修饰模式的改变，同时还表现在组蛋白甲基化修饰模式的改变上。三氧化二砷与去甲基化药物联合应用于体内和体外实验，实验[22-24]结果表明，二者联用后的去甲基化作用增强，也证明三氧化二砷与去甲基化药物具有协同作用。所以，三氧化二砷同时也应具有去甲基化的作用，实验的优点是证明了二者甲基化的机制既有相同的，即抑制甲基化转移酶的活性而达到增强去甲基化的作用,不同在于，三氧化二砷代谢过程中可以消耗甲基的供体，而去甲基化药物则不能通过消耗甲基供体而发挥去甲基化作用。实验不足在于，没有排除三氧化二砷与去甲基化转移酶的相互作用对本实验结果的影响。还有研究[25]表明，三氧化二砷还通过调节基因家族中的促凋亡与抗凋亡蛋白的表达活性，激活促凋亡基因使其表达增加，同时下调抗凋亡基因，此外，还可通过释放细胞色素C途径来使线粒体跨膜潜能丧失及促进活性氧化物的生成等途径促进细胞凋亡。三氧化二砷还可抑制谷胱甘肽过氧化氢酶及半胱天冬酶的活性来促进凋亡。三氧化二砷在细胞内代谢会消耗S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，同时消耗甲基化转移酶，而SAM又是细胞内甲基化转移酶所必需的活性因子，同时SAM又是甲基生成原料，因此，上述结论有可能也发挥着去甲基化作用。综上，三氧化二砷对肿瘤细胞的抑制作用在表观遗传学层面是组蛋白甲基化修饰模式中增强了组蛋白的去甲基化作用，但具体机制尚不完全清晰，这也是如今对三氧化二砷毒性作用研究的热点。

3 三氧化二砷与组蛋白磷酸化修饰的改变

3.1组蛋白磷酸化修饰对基因表达的影响在二十世纪，组蛋白磷酸化被认为是组蛋白最常见的修饰方式，尽管组蛋白的磷酸化很难被发现。直到2009年，国外的5个独立研究小组均发现并捕捉到组蛋白的磷酸化修饰，这一发现具有里程碑意义[26-27]。他们发现组蛋白的磷酸化修饰不仅参与细胞的损伤修复过程，而且还参与着细胞的凋亡过程，随后研究团队将研究拓展至肿瘤的生物学研究中，他们发现肿瘤在生物学的表达及调控中、染色质空间结构中等组蛋白的磷酸化也发生着重要变化，这对肿瘤疾病的研究开创了新思路。近年来，国内的学者也逐渐开始关注组蛋白磷酸化修饰，加大了对其研究的力度。国内学者也在人类多种肿瘤组织细胞中发现并证实了组蛋白磷酸化水平增高，并且发现主要集中在组蛋白H3上的相关氨基酸上，并且磷酸化的程度与肿瘤恶性程度密切相关。这些研究结果表明，组蛋白磷酸化修饰是调控细胞恶性转化的重要表观遗传学改变。大量体外实验证实，多种蛋白激酶包括RSK2(ribosomal protein S6kinase2)、MSK1(mitogen-and stress-activated kinase1)、IKK-α (IkappaB kinase-alpha)、PKC (cAMP dependent protein kinase C)、Fyn及PIM1等参与的多个信号通路调节组蛋白磷酸化水平[28]，从而诱导肿瘤基因的表达。总体来说，组蛋白磷酸化修饰密切参与着组织细胞有丝分裂染色体浓缩、细胞周期及基因转录[29]。

3.2三氧化二砷与组蛋白磷酸化修饰的作用三氧化二砷对肿瘤细胞的抑制作用众所周知，同时组蛋白磷酸化修饰也是组织细胞在增殖及凋亡中的重要环节，所以三氧化二砷对肿瘤细胞的毒性作用与表观遗传中的组蛋白磷酸化修饰也是分不开的，这也是当今医学科研工作者的一个探究方向。近期发表在《Nucleic Acids Res》杂志上的一篇论文[30]，探究三氧化二砷促进细胞凋亡中组蛋白磷酸化修饰的改变，通过采用MTT法测定药物对细胞增殖的影响,使用瑞氏染色法观察细胞形态学变化,流式细胞术测定细胞凋亡率,用磷酸化酶试剂盒分析药物对细胞内磷酸化酶活性的影响，Western blotting检测细胞内PP2A各亚基表达。实验结果显示，磷酸化酶抑制剂能促进三氧化二砷对肿瘤的细胞凋亡，促进三氧化二砷对肿瘤细胞的增殖抑制作用，且随着砷剂药物浓度增加抑制作用显著。最终证明,三氧化二砷在抑制细胞增殖及促进细胞凋亡中，通过抑制细胞组蛋白磷酸化水平来实现自身的毒性作用。此次试验明确证实了砷剂对组蛋白磷酸化修饰的作用，但并未具体到抑制组蛋白磷酸化的哪个通路，且对组蛋白磷酸化对砷剂的不良反应未作进一步研究，我们认为，这些都可作为日后研究的方向。上述的结论与观点在近期国内的大量实验后也得到了论证，但依旧缺乏更进一步的研究。

现阶段的国内外学者主要集中揭开三氧化二砷对肿瘤细胞的毒性作用机制上，通过大量体内外的细胞实验、分子实验得出砷剂的毒理机制，目前我们的成果是丰硕的，但还有不足之处。我们认为，在实验技术的完善及实验设计中应加入个人的特色，敢于创新。未来在砷剂毒理机制表观遗传学研究中，应将多种修饰模式联合研究，以便观察各种机制相互作用。除主要修饰模式之外，组蛋白的其他修饰方式目前国内外研究甚少，不仅与表达活性难以捕捉相关，也与现阶段的实验技术及试剂的研发相关，个人认为，将来这些修饰模式在三氧化二砷的毒理作用机制中也会被发现。

综上所述，目前在表观遗传学层面对三氧化二砷的毒理机制研究最热的依旧是组蛋白的乙酰化修饰，在基因的表观遗传组蛋白修饰模式中，乙酰化修饰也是最为重要，因此医学成果也是最多的。其次为甲基化及磷酸化，但甲基化修饰最为常见，对组蛋白甲基化修饰的研究目前在国内较之前相比明显提高，但目前的研究结果有待提高，不过这也为我们对抗肿瘤药物研制，及癌症患者治疗提供了新的思路。最后，组蛋白的磷酸化修饰在基因的转录调控、细胞染色质凝集、细胞凋亡中起作用，目前国内对其研究相对较少，我们认为在此方面应加强力度，因为清晰的机制是药物研制的基础，对未来联合抗肿瘤药物具有重要意义，对肿瘤患者也是福音。

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