抑制番茄青枯病拮抗菌株的田间生防效果

王丽丽，李 洋，林乐志

(宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040)

番茄青枯病，是由茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种毁灭性的土传细菌病害，是番茄上常见的维管束系统性病害之一，保护地、露地均可发生。南方及多雨年份发生普遍而严重。发病严重时造成植株整株死亡，导致严重减产甚至绝收。

青枯病菌在环境中变异较多，传播途径多样，寄主范围广，对其防治比较困难[1-2]，目前市场上还未有针对青枯病的专用特效药。通过生物防治菌对其进行防治不失为一条既有效又环保的途径，近年来，利用无致病力青枯菌、假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、真菌、噬菌体等来防治番茄青枯病受到了广大学者的关注。芽孢杆菌是多种植物病原菌的拮抗菌，有预防和控制植物病害的功效，能产生具有抗逆性的内生孢子(芽孢)，能耐盐、耐酸、耐高温，且易于保存和运输[3-4]，因此利用芽孢杆菌防治番茄青枯病具有较明显的优势。

本试验通过实验室分离筛选得到的2株拮抗番茄青枯病病原菌的芽孢杆菌菌株进行田间应用，调查菌株对番茄青枯病的田间防控效果，从而明确菌株防控番茄青枯病的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

田间试验在宁波市海曙区古林镇天胜四不用农场选择病情大致相同的区域进行。

试验采用的拮抗菌采用实验室前期分离筛选得到的W118(解淀粉芽孢杆菌)和W12(枯草芽孢杆菌)，菌株发酵液含菌量为1亿个·mL-1以上。其中，W118经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC No.12200)。参试番茄采用当地常规品种申粉8号。

1.2 处理设计

根据前期预试验，混合菌株防控效果较单一的好，因此本试验设置2个处理，分别为混合菌株发酵液处理(W12+W118)和清水对照(CK)，重复3次。

田间观察到番茄植株有青枯病发生时开始施用混合菌株发酵液，每隔7 d施用1次，每株番茄苗浇灌量为10 mL，对照施用等量清水，共计3次。

1.3 调查项目及方法

病情指数及防控效果调查。每次灌菌后统计各处理的病情指数和防控效果。番茄青枯病的分级标准为[5]：0级，植株正常；1级，植株叶片萎蔫程度不超过25%；2级，植株叶片萎蔫程度超过25%且不超过50%；3级，植株叶片萎蔫程度超过50%且不超过75%；4级，植株叶片萎蔫程度超过75%。

病情指数=Σ(病级数×该病级植株数)/(最大病级数×植株总株数)×100；

防控效果/%=(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照病情指数×100。

根际土壤微生物数计数。细菌计数采用牛肉膏蛋白胨固体培养基，放线菌计数采用高氏I号合成培养基，真菌计数采用马丁氏琼脂培养基，病原菌计数采用SMSA(semi-selectivemedium, South Africa)培养基。相关培养基配方如下：

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15～25 g，水1 000 mL，pH值7.4～7.6。

高氏I号合成培养基：可溶性淀粉20 g，KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂粉10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.2～7.4。配置时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1 L。

马丁氏琼脂培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，1/3 000孟加拉红100 mL，琼脂25 g，pH值自然，蒸馏水800 mL，115 ℃灭菌30 min，临用前加入硫酸链霉素0.03 g。

SMSA培养基：胰蛋白胨10 g，甘油5 mL，酪蛋白氨基酸1 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 000 mL。培养基冷却至50 ℃时每250 mL加入1%的多粘菌素B 2.5 mL，1%的结晶紫125 μm，1%的四氮唑盐1.25 mL，1%的杆菌肽625 μmol，0.1%的青霉素125 μmol，1%的氯霉素125 μmol，1%的放线菌酮2.5 mL。

1.4 数据处理

数据采用DPS 7.5软件进行统计分析

2 结果与分析

2.1 对番茄青枯病的田间防控效果

从表1可知，W12和W118的混合菌株能防治田间番茄青枯病，1次灌菌后的防效为 25.6%，3次灌菌后的防效达 43.0%。

表1 拮抗菌株W12和W118混合发酵液对 番茄青枯病的田间防控效果

2.2 对植株根际土壤中可培养微生物数量的影响

由表2可知，施用混合菌株菌液对番茄植株根际土壤中可培养微生物有一定的影响，其中细菌、放线菌都有一定程度的增加，真菌、病原菌有一定程度的减少，使得土壤中微生物向着有益的方向发展[6]，说明施用拮抗菌株对番茄植株根际微生物群落有改善作用。

表2 拮抗菌株W12和W118混合发酵液对 番茄植株根际土壤微生物数量的影响

3 小结与讨论

试验结果表明，高效拮抗菌(W12+W118)经发酵混合后用于田间，灌菌3次后的防治效果达到43.0%，说明施用拮抗菌能有效地防治田间番茄青枯病的发生。

施用生防菌不但可以影响番茄植株根际土壤中的病原菌数量，还可以调节土壤中其他微生物的数量结构。施用拮抗菌后，细菌、放线菌数量均较对照增加，病原菌、真菌数量较对照减少，说明根际土壤微生物区系向着更健康的方向发展。但是，通过调节土壤微生物生态来抑制土传病害的方式，需要较长的时间，因此如要更好地防治青枯病，可能需要连续几年施用拮抗菌，最终才使得土壤能够通过自身的生态调节，达到抑制病害发生的目的[7]。

[1] GRIMAULT V, ANAIS G, PRIOR P. Distribution ofPseudomonassolanacearumin the stem tissues of tomato plants with diff erent levels of resistance to bacterial wilt [J].Plant Pathol, 2010, 43(4):663-668.

[2] SWANSON J K, YAO J, TANS-KERSTEN J, et al. Behavior ofRalstoniasolanacearumrace 3 biovar 2 during latent and active infection of geranium [J]. Phytopathol, 2005, 95(2):136-143.

[3] FRAVEL D R. Commercialization and implementation of biocontrol[J]. Annual Review of Phytopathology, 2005, 43(1): 65-87.

[4] SHODA M. Bacterial control of plant diseases[J]. Journal of Bioscie nce and Bioengineering, 2000, 89(6): 515-521.

[5] 方中达.植病研究方法[M].3版.北京：中国农业出版社，1998.

[6] BOTTOMLEY P J，YARWOOD R R，KAGEYAMA S A， et al. Responses of soil bacterial and fungal communities to reciprocal transfers of soil between adjacent coniferous forest and meadow vegetation in the cascade mountains of oregon[J]. Plant and Soil, 2006, 289(1/2):35-45.

[7] 李红丽，郭夏丽，李清飞，等．抑制烟草青枯病生物有机肥的研制及其生防效果研究[J]．土壤学报，2010，47(4)：798-801.