花龄对兰属4个栽培种花粉活力的影响

李春楠，傅巧娟，赵福康，孙 瑶

(杭州市农业科学研究院 园艺研究所，浙江 杭州 310024)

兰属(Cymbidium)是观赏兰科(Orchidaceae)植物中具有重要观赏价值的属之一。国兰主要是指兰属中的一部分地生种，包括春兰(C.goeringii)、蕙兰(C.faberi)、墨兰(C.sinense)、建兰(C.ensifolium)、寒兰(C.kanran)、春剑(C.longibracteatum)、莲瓣兰(C.lianpan)等，姿态优雅，韵味幽香，文化底蕴深厚。大花蕙兰(Cymbidiumhybridum)是以兰属中一些大花型附生种为亲本通过多代人工杂交培育出的花色美艳、花朵硕大的一类优良品种群。兰属植物不仅本身具有优良的观赏价值，也是兰花品种改良的重要亲本来源。

国兰与大花蕙兰的花粉是以花粉块的形式存在于合蕊柱顶端药帽之下，在显微镜下观察多数由4个花粉细胞结合为四合体[1]。在兰花杂交育种中，花粉活力的强弱直接决定了杂交授粉的成功率，影响授粉、受精乃至坐果整个过程，在远缘杂交中尤为重要。因此，明确亲本的花粉特性和高活力时期有助于提高杂交坐果率，对兰花杂交亲本适宜授粉时间的选择具有指导意义。前人已研究了大花蕙兰、墨兰、春兰等部分品种开花当天的花粉活性[2]、离体萌发条件[3-4]和花粉贮藏特性[2，5]，褚怡等[6]分析了大花蕙兰和部分国兰品种不同开花时间的花粉活力。本文以兰属常见栽培种(大花蕙兰、春兰、蕙兰、墨兰)各5个品种(材料)为试材，采用TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)染色法系统地分析种间不同花龄花粉的活力变化趋势，为杂交亲本选择合适的授粉时间提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为大花蕙兰、春兰、蕙兰和墨兰，各5个品种(材料)。大花蕙兰品种包括九五至尊、KK560、101、712、887；春兰品种包括色花、新月佩、集圆、汪字、雪山；蕙兰品种(材料)包括金奥素、HL-1、HL-2、HL-3、HL-4；墨兰品种包括吴字翠、金华山、幸姬、白墨、企黑。均栽植于杭州市农业科学研究院连栋温室中。

1.2 花粉采集方法

大花蕙兰于开花前2 d(-2 d)至蕾期、花后3、8、13和18 d，分5次取花粉测定活力；春兰、蕙兰、墨兰分别于开花前2 d(-2 d)至蕾期、花后1 d、4d、7 d和10 d，分5次取花粉测定活力。选择晴天上午9:00～10:00采集兰花花粉块，去除药帽，花粉块用硫酸纸包好，带回实验室测定活力。

1.3 花粉活力测定方法

TTC染色法。取新鲜花粉块，捣碎成匀浆，加入0.5%TTC溶液，(25±2)℃条件下黑暗振荡染色1～3 d。镜检时，取1～2滴染色液于载玻片上，盖上盖玻片，置于低倍显微镜下观察。凡被染为红色者为强活力花粉，淡红色者为弱活力花粉，无色者为没有活力或不育花粉。每处理重复3次，每重复观察3个视野，每个视野至少统计100粒花粉。

花粉活力/%=染色花粉个数/花粉总数×100。

1.4 数据处理

在Excel中处理数据，利用DPS v7.05软件中Duncan’s新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 花龄对大花蕙兰花粉活力的影响

在5个大花蕙兰品种中，KK560在各开花时期的花粉活力都较高，呼吸作用强，相比之下，712则偏低。从图1可见，花龄超过3 d，各品种花粉活力均呈下降趋势，其中，KK560和887降速较缓，在整个测定时期持续高活力，花后18 d，有活力的花粉仍保持在60%以上。总体来看，花龄-2 d和3 d的花粉染色率较高，各品种均超过70%。

具有较强活力的花粉通常被TTC染成深红色，

图1 不同花龄大花蕙兰TTC染色情况

而活力稍弱的花粉则被染为淡红色。将大花蕙兰强、弱花粉TTC染色情况区别比较发现(表1)，所有品种的强活力花粉染色率以花龄-2 d和3 d最高，与其余花龄相比差异达到极显著水平；在花后8、13和18 d的活性表现出显著下降的趋势，与花粉活力总趋势相应；弱活力花粉染色率在5个品种间也呈现逐渐下降的趋势，但大部分品种降幅不明显(除101以外)，以KK560和九五至尊变化较小，表明大花蕙兰在花龄-2 d和3 d时强活力花粉占比高，开花3 d后强活力花粉数量急剧减少，可能是引起整体花粉活力减弱的主要原因。

表1 不同花龄大花蕙兰强、弱活力花粉染色率

注：同列无相同大、小写字母者，分别表示组间差异达极显著和显著水平，表2～4同。

2.2 花龄对春兰花粉活力的影响

从图2可见，春兰5个品种花粉活力最高时期为花后1 d。由表2可见，此时，强活力花粉染色率也最高，色花-2 d略高于1 d，但差异不显著。与大花蕙兰情况不同，春兰在花前2 d(-2 d)有3个品种(汪字、色花和雪山)的花粉活力较高，染色率在80%以上，其余2个品种(新月佩、集圆)仅为60%左右。而花龄超过4 d，花粉活力下降显著，至花后10 d，色花和集圆有活力花粉已不足40%。可见，春兰品种间花粉活力趋势表现差别较大，新月佩和集圆花苞开放时花粉活力较高，但4 d后活力下降明显；雪山和汪字在整个测定时期均活性较强(染色率60%以上)；而色花的花粉仅在花前2 d和花后1 d活性较强，其他花龄显著降低，说明该品种强花粉活力时期短暂，在以该品种为父本进行杂交授粉时应予以注意。

图2 不同花龄春兰TTC染色情况

花龄/d强活力花粉染色率/%弱活力花粉染色率/%色花新月佩集圆汪字雪山色花新月佩集圆汪字雪山-230.41aA11.51dD13.82dD33.22bB28.74bAB53.16abAB50.45aA46.39abA50.88aA54.22aA129.50aA32.39aA38.85aA45.88aA32.16aA55.48aA50.94aA45.43abA44.23bB52.53abA411.91bB26.76bB32.05bB32.62bB27.46bB50.94bB48.40abAB48.07aA47.36abAB49.82bA77.54cC17.66cC21.30cC24.84cC21.23cC42.64cC45.29bB43.24bA46.44abAB49.45bA104.72dC12.63dD5.40eE19.94dC13.20dD34.66dD39.81cC34.66cB45.25bAB49.74bA

2.3 花龄对蕙兰花粉活力的影响

图3表明，蕙兰品种花粉活力普遍较高，除HL-4开花前期活性稍差，其余材料在各花龄期的TTC染色率均超过70%。表3显示，从整体趋势来看，蕙兰花粉在整个所测花龄期均能保持较高的活力，然而分别观察强、弱花粉活力数量发现，开花4 d及之前强活力花粉比例显著高于其他时期，说明即使花粉总活力相差不大，但早期开花的强活力花粉占优势，可能对授粉坐果产生一定的影响。

图3 不同花龄蕙兰TTC染色情况

表3 不同花龄蕙兰强、弱活力花粉染色率

2.4 花龄对墨兰花粉活力的影响

本试验选用的墨兰品种中，花粉活力的变化曲线与春兰接近。由图4可见，除幸姬外，其余品种均表现为-2 d和1 d活力最强，且强活力花粉百分数差异显著，开花时间越长则活力下降越快，其降幅超过春兰。表4显示，当花龄为10 d时，有活力花粉数量已降至50%以下，强活力花粉数最高仅为7.79%(白墨)，表明在开花后，随着时间的推移，墨兰花粉活力迅速减弱，授粉时间应选择开花当天或花蕾含苞待放状态时为好。

图4 不同花龄墨兰TTC染色情况

表4 不同花龄墨兰强、弱活力花粉染色率

3 小结与讨论

花粉活力测定常用的方法有离体萌发法、碘-碘化钾染色法和TTC染色法。离体萌发法的人工培养基成分因物种不同而异，须筛选适宜的培养基成分和培养条件，对于萌发困难的物种需添加促萌发物质，否则不足以代表花粉实际萌发状况。由于兰科植物花粉表面包裹了类脂膜，对花粉起到很好的包围保护作用，使其在萌发和染色过程所需时间更长。据报道，台湾金线莲(AnoectochilusformosanusHayata)花粉块的固体培养萌发需要48 h[7]；墨兰最短为24 h，最长需48 h以上；大花蕙兰最短需60 h，最长96 h，且大花蕙兰花粉在筛选过的人工培养基上萌发时间较长，萌芽后很难继续伸长，其人工培养有一定的难度[2-3]；碘-碘化钾染色法根据花粉内积累淀粉含量来间接判断花粉活力，但不适用于大花蕙兰和国兰花粉活力测定[6]；TTC染色法的原理是活力强的花粉具有较强的呼吸作用，所产生的脱氢酶可将无色的氧化型还原成红色的还原型，并将花粉自身染色。褚怡等[6]采用3种染色方法测定大花蕙兰和部分国兰的花粉活力，认为TTC染色法是大花蕙兰和国兰花粉活力测定最直观的方法。凌春英等[2]在比较了大花蕙兰和墨兰花粉离体培养法和TTC染色法后得出，TTC染色法所测定的结果略高于离体培养法，但两种方法所得活力表现基本一致。基于以上研究，本研究采用TTC染色法快速、有效地测定兰花花粉活性，操作简便，耗时短，不受实验条件影响。

早在20世纪80年代，便有研究者对春兰的花粉进行电子显微镜和组织化学研究，阐明花粉壁结构与花粉粘合的关系[8]，孙崇波等[9]利用扫描电镜观察了兰科5个属(包括兰属的6个种)的花粉块形态。前人对兰花花粉组织形态的研究为后期活性鉴定方法探索和花粉的再利用提供了科学依据。本研究分别鉴定了观赏兰属4个种，包括大花蕙兰、春兰、蕙兰和墨兰各5个品种在不同花龄期的花粉活力，旨在确定不同开花时期的花粉活力变化趋势，为杂交育种中最佳授粉时间的选择和提高杂交成功率奠定基础。

从总体趋势来看，大花蕙兰、春兰、蕙兰和墨兰的花粉均以开花当天及花苞待开放时活力较高，且呼吸作用强的花粉数所占比例最大，这与文心兰的花粉活力表现一致[10]。大花蕙兰和蕙兰的花粉活力保持时间长，高活力时期分别能维持在花后8和10 d，与卡特兰的花粉特性类似[11]；春兰和墨兰花粉高活力时期处于开花前4 d，而后逐渐减弱。随着开花时间的延长，4个种的花粉活力均呈下降趋势，以强活力花粉数占比变化最为明显，品种之间具有一定的差异。大花蕙兰和蕙兰在整个测定时期活力较强，而春兰和墨兰花朵开放后花粉活力迅速丧失，其中墨兰的表现尤为显著。在后续的杂交育种工作，笔者检验了部分品种花粉的授粉结实能力，初步验证了本研究得出的花粉活力变化趋势与后续实际授粉结实情况表现一致(数据该文未列出)。然而，与本文结论不同的是，褚怡等[6]认为大花蕙兰与国兰(春兰、春剑、莲瓣兰)的花粉活力随着开花时间的延长，经历从弱变强再变弱的过程。这种在种属不同品种间差异较大的情况，可能与参试品种特性、测定时间、栽培环境条件以及取材时植株的营养状态有关。

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