万载龙牙百合主要病毒的检测及其检测技术的建立

谢晚彬，丁永电

龙牙百合（Lilium brownii var.viridulum）是久负盛名的万载地方特产，万载以龙牙百合种植为主，江西万载、永丰和湖南隆回并称为全国三大龙牙百合产地。龙牙百合富含淀粉、脂肪、蛋白质、维生素等营养成分，以及秋水仙碱、秋水仙胺等具有抑制细胞分裂的药物成分，因而龙牙百合具有很高的营养价值，同时其在癌症的防控上展现出良好的药用价值［1］。百合一般通过种球、株芽等无性方式进行繁殖，在繁殖过程中，一旦发生病毒感染，病毒便会在植株体内生长，进而在植株之间传播，造成百合产量降低，品质下降。侵染百合的主要病毒有黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、百合斑驳病毒（Lily mottle virus，LMoV）和百合无症病毒（Lily symptomless virus，LSV），这 3种病毒发生最普遍，危害最严重［2－4］。在百合生产种植过程中，脱毒苗的应用是防控病毒病的根本措施，而可靠的病毒检测技术是确保脱毒苗真正无毒的保证。因此，建立一种针对万载龙牙百合主要病毒的检测技术，确保脱毒苗真正无毒，对其病毒病的防控具有重要意义。

目前百合病毒的检测方法主要有电镜检测法、指示植物法、酶联免疫法和反转录聚合酶链式反应（Reverse transcription－polymerase chain reaction， RTPCR）法等［5－7］。RT－PCR 法以百合病毒的 RNA 为模板，通过反转录和聚合酶链式反应对RNA进行扩增，根据扩增产物的有无即可检测出病毒的有无，因此与电镜检测法、指示植物法、酶联免疫法相比，RT－PCR法具有快速、灵敏、特异性强、操作简单等优点。目前，关于采用RT－PCR法检测万载龙牙百合主要病毒的研究尚未见报道。因此，我们以万载龙牙百合为试验材料，研究了检测其主要病毒的RT－PCR技术，以期为百合病毒病的防控、脱毒苗的无毒化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试百合

供试百合为龙牙百合，采用五点取样法从万载县白水乡发病田块取样得到。

1.2 主要试剂

总RNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit， Code No.9769）、RT－PCR 试剂盒（TaKaRa PrimeScriptTMOne Step RT－PCR Kit Ver.2，Code No.RR055A）、DNA Marker（2000）均购自日本Takara公司。

引物 CMVF／CMVR、LMoVF／LMoVR、LSVF／LSVR、18SF／18SR由上海生工生物工程有限公司合成，它们的序列参见表1。

表1 试验所用引物

1.3 主要仪器

5804R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）、PEARL微量核酸蛋白分析仪（德国Implen公司）、TP600 PCR仪（日本Takara公司）、DYY－8C电泳仪（北京市六一仪器厂）、TANON－2500电泳凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。

1.4 龙牙百合鳞茎组织的裂解

龙牙百合鳞茎组织的裂解操作步骤如下：（1）将适量新鲜的龙牙百合鳞茎组织置于液氮预冷的研钵中，用研磨杵研磨鳞茎组织，在研磨过程中不断加入液氮，直至将鳞茎组织彻底研磨成粉末状；（2）将50 mg龙牙百合鳞茎组织粉末状样品置于1.5 mL灭菌离心管中，加入450μL Buffer PE，用移液器吹打混匀，使样品充分裂解，直至无明显沉淀，然后将裂解液在 4 ℃下以 12000 r／min离心5 min；（3）将上清液置于1个新的1.5 mL灭菌离心管中，加入45μL Buffer NB，混匀，4 ℃、12000 r／min 离心 5 min；（4）再将上清液置于1个新的1.5 mL灭菌离心管中，加入450μL Buffer RL，混匀，混合液用于总RNA的提取。

1.5 龙牙百合总RNA的提取

龙牙百合总RNA的提取操作步骤如下：（1）往上述混合液中加入250μL无水乙醇，混匀后立即置于 RNA Spin Column中（分 2 次），以 12000 r／min离心1 min，弃滤液；（2）往 RNA Spin Column中加入500 μL Buffer RWA，以 12000 r／min 离心 30 s，弃滤液；（3）往 RNA Spin Column中加入 600 μL Buffer RWB，以 12000 r／min 离心 30 s，弃滤液。 用 Buffer RWB洗涤2次；（4）将 RNA Spin Column以 12000 r／min离心2 min，除去残留液体；（5）将RNA Spin Column置于1.5 mL RNase Free的收集管中，然后在RNA Spin Column膜中央处加入50μL RNase Free dH2O，室温静置5 min 后，以12000 r／min 离心2 min，收集管中收集的滤液即为总RNA提取液。

用PEARL微量核酸蛋白分析仪对总RNA提取液进行浓度和纯度检测，检测其是否符合进行RTPCR的质量要求。

1.6 主要病毒的检测及检测技术的建立

通过RT－PCR法进行龙牙百合主要病毒的检测。 采用引物 CMVF／CMVR、LMoVF／LMoVR、LSVF／LSVR、18SF／18SR从总 RNA提取液中分别扩增CMV、LMoV、LSV等主要病毒和18S rRNA分子。根据RT－PCR试剂盒操作说明，设定RT－PCR反应体系为：2×RT－PCR Buffer 5 μL、RNase－free dH2O 3 μL、总 RNA 提取液1 μL、Forward Prime（10 μmol／L）0.4 μL、Reverse Prime （10 μmol／L） 0.4 μL、RT－PCR polymerase 0.2μL。根据引物的Tm值，并参考相关文献报道［8］，设定RT－PCR 的反应条件为：50℃逆转录30 min；94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃最后延伸7 min。取出RT－PCR产物，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳。

若电泳结果显示扩增出病毒的特异片段，则表明万载龙牙百合感染了该病毒，同时根据相应的RTPCR反应条件，可以建立该病毒的RT－PCR检测技术。若电泳结果显示没有扩增出病毒的特异片段，则将退火温度逐渐降低，先后设定为55℃、50℃，重复上述RT－PCR检测过程。

2 结果与分析

2.1 龙牙百合总RNA的提取

采用总RNA提取试剂盒从龙牙百合鳞茎组织提取总RNA，用PEARL微量核酸蛋白分析仪检测总RNA提取液的浓度和纯度，检测结果显示：总RNA提取液的浓度为 74.449 ng／μL，符合进行 RT－PCR的要求；总 RNA提取液的 A260值为1.861，A280值为0.918，A260／A280值为 2.027，接近 2.0，表明纯度高，也符合进行RT－PCR的要求。

2.2 主要病毒的检测及检测技术的建立

采用引物 CMVF／CMVR、LMoVF／LMoVR、LSVF／LSVR、18SF／18SR从总 RNA提取液中分别扩增CMV、LMoV、LSV等主要病毒和18SrRNA分子（RTPCR的退火温度设定为60℃），对RT－PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，结果图1第2泳道显示从总RNA提取液中扩增出LMoV病毒的特异片段（623 bp）；图1第1泳道和第3泳道分别显示从总RNA提取液中没有扩增出CMV和LSV病毒的特异片段。LMoV病毒的RT－PCR检测技术（条件）为：50℃逆转录30 min；94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃最后延伸7 min。

将退火温度降低为55℃，第2次扩增CMV和LSV病毒，并对RT－PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，结果图2第1泳道和第2泳道分别表明：从总RNA提取液中也没有扩增出CMV病毒的特异片段（255 bp）和LSV病毒的特异片段（439 bp）。

将退火温度降低为50℃，第3次扩增CMV和LSV病毒，并对RT－PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，图3第1泳道和第2泳道分别显示：从总RNA提取液中还是没有扩增出CMV病毒的特异片段（255 bp）和LSV病毒的特异片段（439 bp）。

图1 龙牙百合主要病毒的RT－PCR检测

图2 龙牙百合CMV和LSV病毒的RT－PCR检测

3 讨论与结论

我们在龙牙百合CMV、LMoV、LSV等主要病毒的RT－PCR检测过程中，根据引物的Tm值，并参考相关文献报道［8］，将 RT－PCR的退火温度设定为 60℃，顺利扩增出LMoV病毒的特异片段（623 bp）（图1第2泳道），但未能扩增出CMV病毒的特异片段（图1第1泳道）和LSV病毒的特异片段（图1第3泳道）。为此我们将CMV和LSV病毒检测的退火温度下调至55℃，均只在1000～2000 bp之间扩增出1条DNA片段（图2），与CMV病毒的特异片段（255 bp）和LSV病毒的特异片段（439 bp）长度不符。当将CMV和LSV病毒检测的退火温度进一步下调至50℃，也均只在1000～2000 bp之间扩增出1条DNA片段（图3）。

图3 龙牙百合CMV和LSV病毒的RT－PCR检测

在采用RT－PCR检测百合病毒的文献报道中，大多数通过RT－PCR产物中有无病毒的特异片段来判断被检测的百合是否感染该病毒［9－10］，这可能会因RT－PCR试剂失效和操作失误而造成假阴性的情况。为此我们引入18SrRNA作为内参照，当RT－PCR的退火温度设定为60℃时，顺利扩增出18SrRNA的特异片段（200 bp）（图1第4泳道），但是没有扩增出CMV和LSV的特异片段，从而排除了因RT－PCR试剂失效和操作失误而造成假阴性的情况。

根据以上试验结果，可以得出：万载龙牙百合感染了LMoV病毒，而没有感染CMV病毒和LSV病毒。同时可以确定LMoV病毒的RT－PCR检测技术为：50℃逆转录30 min；94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃最后延伸7 min。另外，本研究建立的RT－PCR检测技术可以用于万载龙牙百合主要病毒的检测，对万载龙牙百合脱毒苗的无毒化生产和病毒病的防控具有重要意义。

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