不同十字花科作物气孔保卫细胞周长和叶绿体数目与其倍性的相关性研究

胡靖锋，兰 梅，徐学忠，杨红丽，张丽琴，刘家佳，赵 颖，和江明*

体细胞融合、花药培养、小孢子培养等再生植株都需要进行倍性鉴定，常用的方法包括流式细胞仪检测［1－2］、植株形态学观察［2］、根尖染色体计数［3］等。流式细胞仪测定结果准确可靠，但是费用较高，不易普及；植株形态学观察周期较长，易受环境等因素影响；根尖染色体计数程序较复杂，且需具有一定理论基础和熟练的操作才能获得可靠的结果，不易大量使用。而利用气孔保卫细胞及叶绿体数目鉴定植株倍性是一种既经济又有效简便的鉴定方法。目前，在大麦［4］、辣椒［5］、枇杷［6］、何首乌［7］等作物上已有相关的研究。本研究通过对不同十字花科作物叶片气孔保卫细胞周长及叶绿体数目与其倍性关系的研究，分析它们之间的差异，找到一种快速、简便、准确鉴定十字花科作物倍性的方法，为十字花科作物倍性鉴定提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

由云南省农科院园艺所提供的试验材料是油菜材料 N001、N002，青梗菜材料 CPC001、CPC002，春菜材料KC01；以及油菜材料、青梗菜材料、春菜材料的小孢子培养再生植株N003、CPC003、KC02。

1.2 试验方法

1.2.1 气孔保卫细胞横纵径及外周长的观察 当植株有4～5片真叶长出后，用镊子小心撕下叶片下表皮，放到滴有一滴清水的载玻片上，用盖玻片压片后置光学显微镜下观察。对同一叶片不同部位取样时，将叶片分为上、中、下三等分，分别进行取样。通过目镜测微尺测出纵径、横径，并作记录，计算叶片气孔保卫细胞外围周长。

气孔保卫细胞的外围周长（L）计算公式：

L＝1.57×［1.5×（A＋B）－（A×B）1／2］

公式中L为气孔保卫细胞的外围周长，A、B分别代表整个气孔保卫细胞横、纵径［8］。

1.2.2 气孔保卫细胞叶绿体数目观察 对各材料的单倍体、二倍体植株进行叶片取样，叶片取上、中、下3个部位，从第4片真叶完全长出开始，撕取样叶的下表皮于载玻片上，并用1%碘－碘化钾染色，加盖玻片后，显微镜下计数气孔保卫细胞内的叶绿体数目［9］。

2 结果与分析

2.1 不同十字花科作物二倍体植株叶片气孔保卫细胞周长的比较

从表1可以看出，不同材料叶片气孔保卫细胞周长之间存在差异。油菜N001的气孔保卫细胞周长最大为75.47μm；其次是油菜N002，其气孔保卫细胞周长为72.06μm；青梗菜CPC001的气孔保卫细胞周长为67.33μm；青梗菜CPC002的气孔保卫细胞周长为62.86μm；春菜KC01的气孔保卫细胞周长为65.82μm；CPC002的气孔保卫细胞周长最小。通过方差分析，各研究材料间的气孔保卫细胞周长差异显著。

表1 不同十字花科作物二倍体植株叶片气孔保卫细胞周长的比较 μm

2.2 不同十字花科作物单倍体植株叶片气孔保卫细胞周长的比较

对油菜、青梗菜、春菜单倍体植株叶片气孔保卫细胞周长进行比较，结果表明（表2）：各材料的气孔保卫细胞周长存在差异。N003的气孔保卫细胞周长为50.74μm，CPC003的气孔保卫细胞周长为47.47 μm，KC02的气孔保卫细胞周长为44.21μm。在3种材料中，气孔保卫细胞周长最大的是N003（油菜），其次是CPC003（青梗菜），KC02（春菜）的最小。通过方差分析，3种材料的气孔保卫细胞周长之间差异显著。

表2 不同十字花科作物单倍体植株叶片气孔保卫细胞周长的比较 μm

2.3 单倍体与二倍体植株气孔保卫细胞周长的比较

以KC01、KC02为供试材料，对其植株气孔保卫细胞周长进行了比较，结果表明：春菜材料单倍体、二倍体植株的叶片上部、中部、下部间气孔保卫细胞周长大小差异不明显，但单倍体与二倍体之间叶片气孔保卫细胞周长大小差异比较明显。KC01植株的叶片上部、中部、下部气孔保卫细胞周长分别是65.59、67.54、64.32μm，KC02植株叶片气孔保卫细胞周长分别是 44.89、42.23、45.51 μm（图 1）。 通过观察叶片气孔保卫细胞周长区别单倍体与二倍体植株较为简便。

图1 单倍体与二倍体植株气孔保卫细胞周长比较

2.4 叶片不同部位气孔保卫细胞叶绿体数目的比较

由表3可以看出，同一材料叶片不同部位气孔保卫细胞叶绿体数目差异不明显，各材料间的叶片气孔保卫细胞叶绿体数目不同，存在明显差异。材料N001、CPC001、KC01的叶绿体数目均在10个以上，N003、CPC003、KC02的叶绿体数目均在10以下。经方差分析，各材料的叶片保卫细胞叶绿体数目差异显著。

表3 不同材料叶片不同部位气孔保卫细胞叶绿体数目的比较 个

2.5 不同倍性植株气孔保卫细胞叶绿体数目的差异

对试 验 材 料 N001、N003、CPC001、CPC003、KC01、KC02进行叶片保卫细胞叶绿体数目观察，试验材料间叶绿体数目存在差异，叶绿体数目分别为14、7、12、8、13、7 个。 二倍体材料为 N001、CPC001、KC01，单倍体材料为 N003、CPC003、KC02。 对试验材料进行叶绿体数目鉴定与形态学鉴定，确定倍性比较鉴定结果一致性，说明叶绿体数目鉴定植株倍性是可行的。

表4 不同倍性植株气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定与形态学鉴定的一致性

3 讨论

利用气孔保卫细胞鉴定植物倍性是一种便捷的方法，许多前人在多种作物上研究了气孔保卫细胞长度与倍性的关系。何婷等［10］对甘蓝型油菜种子萌发的二倍体植株和小孢子来源再生单倍体植株的不同叶位叶片气孔保卫细胞大小进行了测定，考察了不同叶片的保卫细胞长轴长、短轴长以及其周长差异，并对气孔保卫细胞大小与植株倍性的相关性进行了研究。结果表明：油菜单倍体与二倍体叶片气孔保卫细胞的长轴长、短轴长以及其周长存在显著差异，利用长轴与短轴长度计算的周长指标对单倍体与二倍体鉴定具有更宽的区分窗口，可用于油菜双单倍体群体构建中植株倍性的快速鉴定。鲁文英等［11］以饲用甜菜二倍体和四倍体为试验材料，研究了气孔的长、宽度与倍性的关系，结果表明：二倍体植株与四倍体植株的气孔长、宽度之间差异显著。可作为饲用甜菜多倍体育种初期的筛选鉴定指标。祁魏峥等［12］以流式细胞仪的结果为基准，对再生植株叶片气孔保卫细胞周围叶绿体数目，保卫细胞长、宽及其周长进行了研究，结果表明：在保卫细胞长度和周长均能说明倍性的情况下，通过测量保卫细胞的长度来判定倍性更为简便。本研究对油菜、青梗菜、春菜单倍体及二倍体气孔保卫细胞横、纵径及周长进行研究比较，单倍体和二倍体气孔保卫细胞横、纵径、周长数值差异显著，且与前人研究结果相似。各研究作物间的气孔保卫细胞横、纵径及周长间也存在差异；各作物同一叶片不同部位气孔保卫细胞横、纵径及周长间差异不显著。

图2 不同倍性植株叶片气孔保卫细胞叶绿体数目

在气孔保卫细胞叶绿体数目与倍性之间关系的研究方面，鲁文英等［11］以饲用甜菜二倍体和四倍体为试验材料，研究了气孔保卫细胞叶绿体数目与倍性的关系，结果表明：二倍体与四倍体植株的气孔保卫细胞叶绿体数目间差异显著。施先锋等［13］以二倍体西瓜及其同源四倍体为材料，通过观察叶片气孔保卫细胞叶绿体数来鉴定西瓜染色体倍性，结果表明：二倍性间的叶绿体数差异显著。张凌媛等［14］以16个枇杷品种的二倍体和自然多倍体为试材，研究了气孔保卫细胞叶绿体数目和气孔密度与倍性的相关性，结果表明：气孔密度与倍性相关性不显著；多倍体气孔叶绿体数比二倍体有明显增多，差异均达极显著水平，而多倍体之间差异不显著；品种间叶绿体数有明显差异，各品种叶绿体数分布有近似规律。闵子扬等［15］以南瓜胚囊再生植株为材料，采用形态学鉴定法、根尖染色体计数法和气孔保卫细胞叶绿体计数法3种方法对46株南瓜胚囊再生植株的倍性进行鉴定，结果表明：形态学鉴定法只能作为倍性鉴定的一种辅助方法，而染色体计数法虽直接、准确，但效率低，气孔保卫细胞叶绿体计数法高效、简便。胡婷婷等［16］对粳稻F1代花培植株进行倍性鉴定，结果表明：苗期利用印记液撕取法，观察花培植株的气孔形态、大小以及保卫细胞的叶绿体数并辅以形态学鉴定，是粳稻花培植株群体早期倍性快速判别的简单有效的办法。本研究对各作物叶片不同部位保卫细胞叶绿体数目以及叶绿体计数与植株形态鉴定进行比较，同一材料叶片不同部位气孔保卫细胞叶绿体数目差异不明显，各材料间的叶片气孔保卫细胞叶绿体数目差异明显。保卫细胞叶绿体计数与植株形态鉴定倍性结果相吻合。另外，在植株倍性鉴定过程中，采用无菌水处理材料，更容易对叶绿体进行观察计数。

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