基于网络药理学的清开灵注射液作用机制研究Δ

吴嘉瑞，蔺梦娟，刘鑫馗

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

清开灵注射液是由北京中医药大学(原北京中医学院)于20世纪70年代末在古代名方“安宫牛黄丸”基础上研制而成的中药注射剂，目前有注射液和冻干粉末2个剂型，均由胆酸、猪去氧胆酸、水牛角、黄芩苷、栀子、金银花、板蓝根和珍珠母组成，具有清热解毒、化痰通络和醒神开窍的功效，尤其在脑血管疾病、上呼吸道感染、肝炎和高热等方面具有良好的临床疗效。目前，清开灵注射液已进入国家基本药品目录，是首批全国中医院急诊科(室)必备中成药之一。方中胆酸、猪去氧胆酸为牛黄的替代品，牛黄味苦性凉，善清心肝之邪热，能清心解毒、息风定惊、豁痰开窍而醒神，为君药；牛黄主要成分为胆酸与去氧胆酸，而猪去氧胆酸为异去氧胆酸，效用与去氧胆酸相似，因此，方中胆酸、猪去氧胆酸共为君药。水牛角为犀角的代用品，两者化学成分和药理作用相似，水牛角苦寒入心肝血分，能清热凉血、泻火解毒定惊；黄芩苷代表原方中黄芩，黄芩性味苦寒，功效清热燥湿、泻火解毒，能泻胆、肺之实火，兼除湿热；金银花为甘寒之品，清热解毒、疏散风热，善清肺、心、胃之热毒，有透热达表、透营转气之功；三者共为臣药，助君药清心包热毒之力。栀子苦寒清降，泻三焦火邪而导热下行、泻心火而除烦，兼清利肝胆湿热、凉血解毒；板蓝根苦寒，入心、胃经，善清热解毒、凉血利咽；两者佐助君、臣药加强全方清热解毒之功。珍珠母咸寒质重，入心、肝经，既清肝平肝，又镇惊安神，佐助臣药水牛角清热、镇惊和安神。全方苦寒、甘寒和咸寒并用，共奏清热解毒、化痰通络、醒神开窍和镇惊安神之功[1-3]。根据君臣佐使的组方原则及七情和合的配伍原则，结合药物性味和功效，清开灵注射液全方药物可以划分为“胆酸-猪去氧胆酸”“水牛角-珍珠母”“黄芩苷-栀子”和“金银花-板蓝根”4个组合(或称药对)，药对内部均为相须或相使配伍，各药对之间又相辅相成，相互配合，形成全方。实验研究结果显示，清开灵注射液具有抗菌、抗病毒、解热、抗炎、免疫调节、抗肿瘤、抗脑缺血、改善学习记忆、保肝及抗心肌缺血等多种药理作用。也可见以往对清开灵注射液的作用机制研究多采用动物实验、细胞实验等方法对其某一作用机制进行研究，难以获得其作用机制网络的整体面貌。近年来，网络药理学融合系统生物学、多向药理学、生物信息学和计算机科学等多学科的技术、内容，进行“疾病表型-基因-靶点-药物”等多层次网络的构建，探索药物与疾病间的关联性，指导新药研发，阐明药物作用机制，其整体性、系统性及复杂性的研究视角和研究方法，与中医药的特点不谋而合[4]。因此，本研究基于网络药理学方法，通过构建清开灵注射液的“药物-成分-靶标-疾病”多层次生物网络，结合基因功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，开展清开灵注射液的作用机制研究。

1 资料与方法

1.1 药物分子信息的收集和活性分子的筛选

(1)胆酸、黄芩苷：通过检索中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，分别获得两者的分子信息，包括分子名称、InChI Key、相对分子质量(molecular weight，WM)、类药性(drug-likeness，DL)、辛醇-水分配系数(ALogP)、血-脑脊液屏障(blood brain barrier，BBB)、氢键配位电子供体数目(Hdon)、氢键配位电子受体数目(Hacc)、可旋转键数目(RBN)、分子极性表面积(TPSA)、半衰期(half life，，HL，t1/2)和分子结构。(2)栀子、金银花和板蓝根：①通过检索TCMSP数据库，分别获得三者的药物成分及分子信息(同胆酸、黄芩苷)。其中，考虑到含糖基的化合物在体内可能通过糖苷酶水解作用被去糖基，TCMSP数据库中也收录了这些化合物的糖苷配基，并将其命名为“化合物_qt”，因此，所获得三者的药物分子中可能也包括这些化合物的糖苷配基[5]。②活性分子的筛选：中药成分复杂，经过制剂工艺和体内过程，并非所有成分均能进入体内发挥药效；考虑中药注射剂的剂型特点，结合对药物体内过程[吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及排泄(excretion)，ADME]相关性质的预测，筛选可能功效物质和活性分子。由于研究资源和手段的限制，结合文献中已有的研究成果，通过多次预实验，最后将ALogP<5和DL≥0.18作为ADME性质参数预测清开灵注射液中栀子、金银花和板蓝根所提供的有效成分的条件。其中，ALogP是反映生物膜之间通透性的主要物理化学参数之一，TCMSP数据库中的ALogP由软件ALOGPS 2.1计算得出[5]，根据里宾斯基五规则设置该参数的阈值；DL指化合物与大多数已知药物之间在理化性质及结构特征等方面的相似性[5-6]，TCMSP数据库中的DL依据Tanimoto系数计算得出，描述了TCMSP数据库中的化合物与DrugBank数据库中所有药物之间的相似度，根据所有相似度的平均值DL=0.18设置该参数阈值[5]。③结合相关文献[3]，在板蓝根中补充腺苷这一成分，通过检索中药综合数据库(traditional Chinese medicine integrated database，TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid/search/)并链接到PubChem Compound数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)获得相应分子信息，包括分子名称、InChI Key、WM、辛醇-水分配系数(XLogP3)、Hdon、Hacc、RBN、TPSA和分子结构。(3)猪去氧胆酸：检索PubChem Compound数据库，获得猪去氧胆酸的分子信息(同腺苷)。(4)水牛角、珍珠母：通过检索TCMID数据库和相关文献[1，7]，获得水牛角、珍珠母的药物成分，通过链接PubChem Compound数据库获得相应分子信息(同腺苷)。

1.2 分子互作靶标和疾病信息的收集

(1)胆酸、黄芩苷、栀子、金银花和板蓝根：检索TCMSP数据库获得各药味相应分子的作用靶标，其中，栀子、金银花和板蓝根仅获取所预测活性分子的靶标；根据所获靶标，进一步检索TCMSP数据库获得靶标相关的疾病。另外，板蓝根中腺苷对应的靶标和疾病通过TCMID数据库获得。(2)猪去氧胆酸：利用PubChem BioActivity Analysis Service(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi)获得猪去氧胆酸分子的作用靶标；然后，在TCMSP数据库中检索获得靶标相关的疾病。(3)水牛角、珍珠母：通过检索TCMID数据库获得相应分子的靶标及靶标相应疾病。

1.3 靶标相应基因的获取

检索Uniprot(http://www.uniprot.org/)中的UniprotKB数据库，检索式为“organism：‘homo sapiens’AND reviewed：yes”。将检索结果以Excel格式导出，共20 169条记录，即获得UniprotKB/Swiss-Prot数据库中人类的相关靶蛋白及其对应基因的记录。采用Excel软件的“VLOOKUP”函数匹配“1.2”项下所获得靶标对应的基因信息。非蛋白质的靶标或其他致病菌中的靶标，通过检索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者利用多种搜索引擎检索获得。

1.4 网络构建与网络分析

将清开灵注射液整体处方对应的组方药物、分子、靶标和相关疾病导入Cytoscape 3.4.0软件(http://www.cytoscape.org/)构建其“组方药物-分子-靶标-疾病”网络，利用Cytoscape 3.4.0软件的NetworkAnalyzer工具计算网络拓扑参数，包括度值(Degree)、介数(betweenness centrality，BC)等[2，8-9]，利用Degree和BC排序确定关键节点，探讨清开灵注射液的主要作用靶标、主治疾病及其作用机制。

1.5 基因本体(gene ontology，GO)分类富集分析

GO是主要为了统一表征所有物种的基因及基因产物的性质而发起的生物信息学计划[10]。GO数据库(www.geneontology.org)旨在建立一套适用于所用物种的、对基因和蛋白质功能进行限定和描述的、并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。GO有3个分类：(1)细胞组分(cellular component，CC)，指基因产物位于何种细胞器或基因产物组中(如糙面内质网、核或核糖体和蛋白酶体等)，表明基因产物在什么地方起作用；(2)分子功能(molecular function，MF)，描述基因产物在分子生物学上的活性，如催化活性或结合活性；(3)生物学过程(biological process，BP)，指由分子功能有序组成的，具有多个步骤的一个过程。GO的结构是个有向无环图，每个语义多在自己的类别中与其他语义相关联，有时会与其他类别的语义相关联；语义之间的关系为“is a”或“part of”。利用Cytoscape 3.4.0软件Apps中的BiNGO 3.0.3对清开灵注射液整体处方所对应的基因集合进行GO分类富集分析[11-12]。BiNGO Settings面板的参数设置如下：簇名分别命名为“DZ-MF”“DZ-BP”和“DZ-CC”；选择“paste genes from text”，将基因名称复制粘贴到输入框中，每个基因单独占一行；输出内容和方式依次选择“overrepresentation”“visualization”和“overrepresented categories after correction”，参照集合选择“use whole annotation as reference set”，物种选择“Homo Sapiens”，以Cytoscape层次网络图形式输出该基因集合相较于人类基因组比例更高的GO分类注释；选择“Hypergeometric test”的统计方法和“Benjamini & Hochberg False Discovery Rate(FDR)correction”的P校正法，设置显著性水平为P<0.01；分别选择“GO_Molecular_Function”“GO_Cellular_Component”和“GO_Biological_Process”进行GO-MF、GO-CC、GO-BP的富集分析[6]。

1.6 KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8数据库(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/)进行通路富集分析[13]。在DAVID的基因列表通用管理面板中复制粘贴基因列表，选择基因名称对应的基因标示符“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，提交基因列表；为所提交的基因列表选择对应的物种“Homo Sapiens”，背景也选择“Homo Sapiens”，即以人类全基因组为背景基因和参照集合。选择分析工具“Functional Annotation Tool”，采用默认的阈值EASE=0.1 and Count=2(EASE Score的阈值指最大P，Count的阈值指与某一通路相关的基因数目的最小值，统计检验基于modified Fisher Exact法)，可获得通路富集结果，点击链接可以查看KEGG(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)数据库中对应的通路图及其详情。

1.7 关键模块的识别与模块分析

利用Cytoscape 3.4.0软件Apps中的MCODE 1.4.1对清开灵注射液的“组方药物-分子-靶标-疾病”网络进行关键模块的识别，参数设置采用默认值；利用Cytoscape 3.4.0软件及其Network Analyzer工具查看所识别的模块，并进行网络特征分析，利用DAVID 6.8数据库对模块中靶标的对应基因进行GO-BP富集分析和KEGG通路富集分析，探讨清开灵注射液中这些模块的主要作用及其作用机制。

1.8 具有BBB通透性的分子的作用机制分析

在化学成分分子信息分析中，根据药物分子的性质参数对其BBB穿透性进行了预测，现将筛选出来的具有一定BBB通透性的药物分子，结合清开灵注射液整体处方的“组方药物-分子-靶标-疾病”网络，对这些分子节点进行网络特征分析；再利用DAVID 6.8数据库对这些分子作用靶标的基因进行GO-BP富集分析和KEGG通路富集分析，探讨清开灵注射液在中枢神经系统疾病等方面的作用机制。

2 结果

2.1 化学成分分子信息分析

清开灵注射液整体处方共筛选出116个药物成分，其中，77个(占66.4%)分子符合“Lipinski’s rule of five”；24个分子的BBB>-0.3且TPSA<90 Å2，分别为C0006、C0010、C0011、C0012、C0017、C0021、C0024、C0025、C0028、C0030、C0031、C0038、C0041、C0042、C0060、C0061、C0064、C0065、C0069、C0073、C0084、C0090、C0097和C0101，5个分子仅有TPSA且TPSA<90 Å2，分别为C0007、C0018、C0037、C0083和C0112，提示上述29个分子可能具有一定的BBB穿透性，见表1。利用SPSS 20.0软件对清开灵注射液的116个药物分子的分子信息进行统计描述，结果显示，116个药物分子的均值符合“Lipinski’s rule of five”，且108个药物分子有DL且DL≥0.18，说明116个药物分子总体具有较好的DL。

2.2 “药物-成分-靶标-疾病”网络分析

清开灵注射液的“药物-成分-靶标-疾病”网络见图1，该网络图含有2 324个节点(8个药物，116个成分，1 271个靶标，929种疾病)和3 786条边线，不同节点分别代表药物、成分、靶标和疾病，连线表示各节点之间的相互作用关系，节点大小、节点名称字号大小与Degree呈正相关，连线粗细与Edge Betweenness呈正相关。可见，清开灵注射液中各药物之间存在各种相互作用关系，不同药物可以有相同的化合物分子，同一化合物分子可以作用于不同的靶标，不同的化合物分子也可作用于同一靶标，一个靶标可以与多种疾病相关，一种疾 病可以涉及多个靶标，形成复杂的网络，也充分体现了清开灵注射液作为中药复方制剂的多成分、多靶标和多途径的治疗机制。对该网络的拓扑学性质进行分析，采用Degree和BC排序确定关键节点。清开灵注射液的“药物-成分-靶标-疾病”网络中：(1)Degree≥20的化合物分子22个(占20.0%)，其中Degree≥50的靶标有8个，分别为腺苷、胆固醇、精氨酸、天门冬氨酸、槲皮素、芹菜素、山柰酚和木犀草素；(2)degree≥20的靶标有24个(占1.9%)，包括前列腺素内环氧酶2、热休克蛋白90α、前列腺素内环氧1、凝血酶原、二肽基肽酶4、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、雄激素受体、凝血因子X、5-脂氧合酶、β2肾上腺素能受体、碳酸酐酶2、DNA拓扑异构酶2α、蛋白激酶A催化亚基C-α、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶催化亚基γ亚型、细胞核受体共激活剂2、胰蛋白酶-1、钙调蛋白、雌激素受体、诱导型一氧化氮合酶2、内皮型一氧化氮合酶3、肿瘤坏死因子、细胞周期蛋白依赖性激酶2、钠通道蛋白5型亚基α和丝裂原活化蛋白激酶14；(3)Degree≥5的疾病有24种(占2.6%)，主要涉及恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌及实体肿瘤等肿瘤疾病，心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压病及心肌梗死等循环系统疾病，阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统疾病，非胰岛素依赖性糖尿病、肥胖等代谢性疾病，精神分裂症、焦虑症等精神障碍和哮喘、炎症、疟疾、骨关节炎及疼痛等疾病。

表1 清开灵注射液116个药物分子的分子信息 Tab 1 Statistical results of information of the 116 drug molecules of Qingkailing injection

图1 清开灵注射液的“药物-成分-靶标-疾病”网络 Fig 1 “Drug-composition-target-disease” network of Qingkailing injection

2.3 GO分类富集分析

通过BiNGO获得了清开灵注射液对应基因集合中1 218个基因的分子功能注释信息，1 214个基因的细胞组分注释信息，1 204个基因的生物学过程注释信息。进一步对以上基因注释信息进行分类富集分析：(1)GO-MF获得318条富集结果(其层次网络过于复杂庞大，未在文中表示)，主要涉及跨膜受体活性、受体活性、G-蛋白耦连受体活性、信号转导活性、分子传感器活性、受体结合、转运活性、催化活性、蛋白结合、核苷结合、腺嘌呤核苷酸结合、腺嘌呤核糖核苷酸结合、ATP结合、嘌呤核苷酸结合、核苷酸结合、核糖核苷酸结合、嘌呤核糖核苷酸结合和水解酶活性等方面；(2)GO-CC获得123条富集结果，其层次网络见图2(节点大小代表基因数量多少，颜色深浅代表P大小)，主要涉及细胞膜必需组分、细胞膜固有组分、细胞膜部分、细胞碎片、细胞膜、不溶性碎片、膜碎片、细胞外间隙、细胞外区域、细胞质基质、细胞质、线粒体、细胞器膜和细胞内膜系统等方面；(3)GO-BP获得1 528条富集结果(其层次网络过于复杂庞大，未在文中表示)，主要涉及化学刺激响应、信号通路、信号传递、生物过程正性调控、刺激响应、多细胞生物过程、代谢过程、初级代谢过程、细胞代谢过程、生物调控、细胞过程、发育过程、生物过程调控、细胞过程调控、代谢过程调控和多细胞生物发育等方面。

2.4 KEGG通路富集分析

利用DAVID数据库对清开灵注射液的基因集合进行KEGG通路富集分析，阈值参数设置为EASE=0.01，Count=2，共获得134条富集结果，其中EASE<0.01，Count≥10，FDR<0.01的通路，共19条，主要包括6条信号传导相关通路、5条代谢通路、5条生物系统相关通路(涉及消化系统、内分泌系统、免疫系统及神经系统等)和3条疾病通路(肿瘤疾病和感染性疾病)。具体包括：神经活性配体-受体相互作用，环磷腺苷信号通路，钙离子信号通路，环磷鸟苷-蛋白激酶G信号通路，过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路，肿瘤坏死因子信号通路，卵巢类固醇合成，精氨酸生物合成，抗菌药物生物合成，嘌呤代谢，丙氨酸、天门冬氨酸及谷氨酸代谢，胆汁分泌，脂肪细胞脂解作用调控，趋化因子信号通路，谷氨酸能突触，生物钟周期变化，恶性肿瘤通路，乙型肝炎和胰腺癌。

2.5 模块识别与模块分析

尽管网络的模块属性较低，但可能由于该网络比较复杂，利用MCODE进行模块识别，仍得到6个模块，见表2，其节点具体名称见表3。进一步利用DAVID平台对6个模块中的所有靶标的基因进行GO生物学途径富集分析和KEGG通路富集分析，分析模块的主要作用机制。阈值参数设置为EASE=0.05，Count=2，共获得62条GO生物学途径富集结果和44条KEGG通路富集结果。其中：(1)EASE<0.05，Count≥10，FDR<0.01的GO生物学过程注释有8条，依次为心率调控、平滑肌收缩调控、游离型钙离子的释放介导的心肌收缩的调控、利阿诺定敏感性钙释放通道活性调控、心肌收缩调控、胞质分裂调控、G-蛋白耦连受体信号通路和环核苷酸代谢过程正调控；(2)EASE<0.05，Count≥10，FDR<0.01的KEGG通路有6条，依次为心肌细胞肾上腺素、环磷鸟苷-蛋白激酶G信号通路、钙离子信号通路、环磷腺苷信号通路、神经活性配体-受体相互作用和瞬时受体电位通道的炎症介质调控。

2.6 具有BBB通透性的分子的作用机制分析

通过化合物分子性质预测，预测出29个分子可能存在一定的BBB通透性，分别来自猪去氧胆酸(1个分子)、水牛角(4个分子)、珍珠母(2个分子)、栀子(4个分子)、金银花(5个分子)和板蓝根(16个分子)，其中某些化合物分子为多个药物所共有。在清开灵注射液的“药物-成分-靶标-疾病”网络(见图1)中，这29个化合物分子共涉及582个靶标和590种疾病，其中Degree≥20的成分、靶标和Degree≥5疾病见表4。进一步利用DAVID 平台对29个化合物所有靶标的基因集合进行GO生物学途径富集分析和KEGG通路富集分析，分析29个化合物的主要作用及作用机制。阈值参数设置为EASE=0.01，Count=2，共获得322条GO生物学途径富集结果和60条 KEGG通路富集结果。其中：(1)EASE<0.01，Count≥2，FDR<0.01的GO生物学过程注释有76条，前20条结果依次为胆固醇代谢过程、胆固醇体内平衡、脂蛋白代谢过程、胆固醇生物合成过程、脂质代谢过程、胆固醇流出、对药物的响应、离子通道型谷氨酸受体信号通路、脂质转运、胆固醇逆转运、高密度脂蛋白粒子重构、甘油三酯代谢过程、固醇代谢过程、氧化还原过程、磷脂流出、对营养物的响应、甘油三酯体内平衡、对酒精的响应、化学突触传递和类维生素A代谢过程；(2)EASE<0.01，Count≥2，FDR<0.01的KEGG通路有19条，包括2条信号传导相关通路、9条代谢通路、3条生物系统相关通路(涉 及神经系统、消化系统)和5条疾病通路，具体为过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路，神经活性配体-受体相互作用，抗菌药物生物合成，丙氨酸、天门冬氨酸及谷氨酸代谢，类固醇生物合成，精氨酸生物合成，代谢通路，丙酮酸盐代谢，碳代谢，初级胆汁酸合成，萜类化合物基础合成，谷氨酸能突触，脂肪的消化与吸收，胆汁分泌，尼古丁成瘾，可卡因成瘾，肌萎缩侧索硬化症，疟疾和苯丙胺成瘾。

图2 清开灵注射液相应基因GO细胞组分分类的层次网络 Fig 2 Hierarchical network of GO classified molecular function of Qingkailing injection related genes

排序模块节点得分/分1T0776、T0202、T1213、C0101、T0232、C0017、C0024、T0859、T0852、T09343.5562C0092、C0031、T1105、C0034、T0342、T07623.2003T0104、D0480、T0103、D05352.6674T0377、T0785、D0181、C00852.6675D0792、T0221、D0747、T11692.6676C0077、D0175、T0783、T07822.667

表3 6个模块中所涉及的节点名称 Tab 3 Names of nodes involved in the 6 modules

表4 具有BBB通透性的29个化合物及其靶标、疾病和 网络参数(化合物分子、靶标Degree≥20，疾病Degree≥5) Tab 4 29 chemical components with permeability of blood cerebrospinal fluid barrier and their targets, diseases and network parameters(chemical components molecules, targets degree≥20, disease degree≥5)

3 讨论

网络药理学研究策略具有整体性、系统性的特点，这与中医药整体观与辨证论治的原则不谋而合[14]。目前，已有诸多研究应用网络药理学方法进行中药潜在活性成分和作用靶点的预测及中药作用机制的阐述[15-18]。为了从系统层面研究清开灵注射液的作用机制，本研究构建了清开灵注射液整体处方的“药物-成分-靶标-疾病”网络，从整体角度体现出了清开灵注射液在疾病治疗中多成分、多靶标和多途径相互配合发挥综合治疗效果的作用机制，这与清开灵注射液的药理作用研究进展的综述结果一致。进一步通过网络拓扑学分析，发现该网络同样具备部分无标度、小世界的网络特性，说明网络中存在关键节点。网络关键节点分析结果表明，清开灵注射液可能通过作用于疾病相关的多个关键靶标前列腺素内环氧酶2、前列腺素内环氧酶1、热休克蛋白90α和过氧化物酶体增殖物激活受体γ等，在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、代谢性疾病、炎症及疼痛等疾病中发挥治疗作用。

考虑到清开灵注射液整体处方的节点较多，网络较复杂，且不同药物涉及的化合物成分、靶标和疾病来自多个数据库，仅利用关键节点分析对于整个网络的认识不够充分。因此，进一步尝试运用模块分析方法探讨清开灵注射液整体处方“药物-成分-靶标-疾病”网络的复杂机制，对所得6个模块的基因集合进行GO生物学过程富集分析和KEGG通路富集分析。结果表明，清开灵注射液参与的多个生物学过程、信号通路与心肌梗死、缺血性心脏病等心血管疾病密切相关，如心率调控、心肌收缩调控、G-蛋白耦连受体信号通路和环核苷酸代谢过程正调控等生物学过程，心肌细胞肾上腺素信号通路、环磷鸟苷-蛋白激酶G信号通路、钙离子信号通路和环磷腺苷信号通路等信号通路。但是，结合文献报道和临床实际情况可见，清开灵注射液在临床上主要用于脑血管疾病的治疗，用于心血管疾病的治疗较少。一方面，结合既往对清开灵注射液致不良反应的研究发现，清开灵注射液确实存在心血管系统方面的不良反应，如心动过速、心动过缓和诱发洋地黄毒性反应等[19]；另一方面，赵丽红等[20-22]以急性缺血心肌-再灌注大鼠模型进行的动物实验研究结果表明，清开灵注射液对大鼠急性缺血心肌-再灌注损伤具有保护作用。这些均说明心血管系统确实是清开灵注射液的作用部位，但其未被应用于相关疾病的治疗中，值得进一步深入研究。

另外，结合清开灵注射液醒神开窍的功效及其在脑血管疾病的确切疗效，着重对清开灵注射液116个化合物中的29个具有一定BBB通透性的成分进行了亚网络分析。网络关键节点分析结果表明，其主要涉及的疾病为恶性肿瘤和阿尔茨海默病等，但未见急性脑梗死、脑出血等脑血管疾病。结合4个药对及清开灵注射液整体处方“药物-成分-靶标-疾病”网络的分析结果，发现在关键疾病节点中均未见急性脑梗死、脑出血等脑血管疾病，这与清开灵注射液的临床实际应用情况不相符。究其原因，可能与学术的研究热点(如阿尔茨海默病是目前学术界的研究热点)和数据库的相关信息收录存在一定的缺陷(如更新不及时、收录不全面和收录学术研究热点的概率偏高)等有一定的关系。值得注意的是，虽然本研究对清开灵注射液的4个药对及整体处方的“药物-成分-靶标-疾病”网络的关键节点进行分析，未见有脑缺血、中风等典型脑血管疾病作为关键的疾病节点，但有炎症、动脉粥样硬化、高血压病及血脂异常等相关病理或疾病作为关键的疾病节点。

此外，通过对29个具有一定BBB通透性的成分对应基因集合的KEGG通路富集分析发现，该亚网络与多条成瘾性疾病的通路密切相关，如尼古丁成瘾通路、可卡因成瘾通路和苯丙胺成瘾通路。刘宝录等[23]曾用地坛牌清开灵注射液静脉滴注给药治疗121例鸦片或海洛因等毒品成瘾的吸毒者，结果显示，119例痊愈，2例因依从性较差而治疗无效；近期治疗效果方面，一般使用清开灵注射液治疗7～10 d后，患者躯体依赖基本好转，治疗月余后痊愈；长期治疗效果方面，使用清开灵注射液治疗痊愈后，需配合一段时间的心理治疗或给予抗焦虑药治疗2～3个月，可巩固疗效。该临床报道和本研究结果佐证了清开灵注射液治疗成瘾性疾病的可行性，值得进一步研究。

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