育肥猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和圆环病毒混合感染的诊断

2018-03-01牛绪东冯学俊马洪超张元瑞葛利江刘建柱

中国动物检疫 2018年2期

牛绪东，冯学俊，任禾，马洪超，张元瑞，葛利江，刘建柱

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；2.中国动物疫病预防控制中心，北京 100125）

猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科水痘病毒属的猪疱疹病毒1型伪狂犬病毒（PRV）感染引起的一种急性传染病。仔猪感染PRV后表现腹泻和神经症状，病死率高，育肥猪和成年猪感染后表现呼吸道症状，长期排毒，死亡率低[1]。近年来，PRV野毒感染情况较为严重。经检测，群体PRV gE抗体阳性率超过20%[2]。猪瘟（CSF）是由黄病毒科猪瘟病毒属猪瘟病毒（CSFV）感染引起的一种急性、热性、接触性传染病，具有高传染性和致死性，是威胁养猪业的主要传染病之一[3]。猪圆环病毒病（PCVD）是由圆环病毒科圆环病毒属的猪圆环病毒2型（PCV2）感染引起的多个与之相关疾病的统称[4]。

2017年8月1日，对山东省临沂市临沭县店头镇店头村某养殖户的1头体重约80 kg的病死猪进行了剖检、问诊和PCR检测，最终确诊该死猪为PRV、CSFV和PCV2混合感染。现总结如下。

1 发病情况及症状

该猪场饲养有经产母猪和育肥猪。2017年8月1日前后，仅育肥猪群发病。病初，病猪精神沉郁，喜卧、扎堆，采食量减少，甚至不食；咳嗽、气喘，鼻孔处可见白色泡沫状液体；呕吐，呕吐物较黏，呈白色或淡黄色；随后，可见皮肤发白，贫血。发病第3天开始拉稀，粪便呈暗灰色，体温多在40～41.7 ℃之间。最后，出现眼睛呆滞、倒地和抽风等神经症状，多数于发病后第4天开始死亡。死后局部皮肤呈现暗红色（图1），鼻孔处有大量淡黄色黏液及白色泡沫状液体（图2）。当地兽医诊治结果不一。曾肌肉注射多西环素、氟苯尼考及黄芪多糖等，但发现均无疗效。该猪场曾对母猪免疫注射了CSF细胞苗、猪PR疫苗、猪细小病毒疫苗和猪口蹄疫疫苗，但对育肥猪仅注射了CSF细胞苗。

图1 皮肤呈现暗红色区域

图2 鼻孔处流出带有泡沫的黏液

2 剖检变化

病死猪全身淋巴结，尤其是头颈部及肺门淋巴结出现髓样肿大、出血、坏死（图3）；肝脏肿大、出血，并有大量黄白色坏死灶（图4）；心包积有少量淡黄色液体（图5），心外膜出血并附有少量纤维素性渗出物，心内膜出血（图6）；脾脏轻度出血、肿大；喉头和气管黏膜充血潮红，气管及支气管内有大量泡沫状液体（图7）；胸腔积有淡黄色液体（图8），肺脏严重出血、水肿（图9），并有弥漫性坏死灶（图10）；扁桃体及咽喉部黏膜严重出血、肿胀、坏死（图11）；肾脏轻度肿大，表面有多个突起的白色结节（图12）；靠近贲门处的食道黏膜潮红，且有大量点状坏死灶（图13），胃底及幽门处黏膜有多处较深的溃疡灶（图14）；大肠黏膜出现“钮扣状”溃疡，回盲口处有大量大小不一的坏死灶（图15）；硬脑膜无明显变化，软脑膜充血、出血、水肿（图16）。

图3 淋巴结髓样肿大、出血、坏死

图4 肝脏肿大出血并有黄白色坏死灶

图5 心包积有淡黄色液体

图6 心内膜出血

图7 气管黏膜潮红，气管及支气管内有大量泡沫状液体

图8 胸腔内积有淡黄色液体

图9 肺脏严重出血和水肿

图10 肺脏切面可见弥漫性坏死灶

图11 扁桃体及咽喉部黏膜出血和坏死

图12 肾脏上可见许多突起的白色结节

图13 食道黏膜潮红且有大量点状坏死灶

图14 胃黏膜有多处溃疡灶

图15 大肠黏膜有“钮扣状”溃疡

图16 软脑膜充血、出血、水肿

3 实验室诊断

3.1 材料

RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒和猪H1N1流感的PCR扩增引物：购自上海生工生物公司；CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和PRV的PCR扩增引物：购自北京伟嘉集团山东检测中心。

3.2 方法

采集病死猪的脑、下颌淋巴结、肺脏、肝脏和脾脏等组织病料，提取5种病毒基因组。

3.2.1 CSFV和PRRSV 按照RNA提取试剂盒说明书进行RT-PCR检测。扩增片段大小分别为272 bp和511 bp。产物通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳观察结果。

3.2.2 PRV 用病死仔猪的脑和下颌淋巴结提取病毒的DNA进行PCR检测。目的片段大小为292 bp。采用 25 µL PCR 体系：DNA 样本1 µL，2×Taq master Mix 12.5 µL，引物 F/R 各 0.5 µL，灭菌 dd H2O 11.5 µL。PCR 程序：95 ℃ 5 min；95 ℃30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，32 个循环；72 ℃7 min，4 ℃保存。PCR产物通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳观察结果。

3.2.3 PCV2 按照DNA提取试剂盒说明书进行PCR检测，对采取的病料进行DNA提取。根据董亚青等[5]的方法设计PCV2引物序列。上游引物序列：5´-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3´，下游引物序列：5´-TATGGAAATTCAGGGCATG-3´。目的片段大小515 bp。采用25 µL PCR体系：DNA 样本 1 µL，2×Taq master Mix12.5 µL，上下游引物各0.5 µL，灭菌dd H2O 11.5 µL。PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、48 ℃ 25 s、72 ℃ 30 s，32个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。将PCR产物通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳后观察结果。

3.2.4 猪流感病毒（SIV）根据GenBank登录的猪 H1N1流感（GenBank：AF091308.1）参考株HA基因核苷酸序列进行RT-PCR检测，设计用于扩增猪H1N1流感的PCR引物。目的片段大小为563 bp。上游引物序列：5´-TCATCACTTCAGACGCACCAC-3´；下游引物序列：5´- ACATACTCTTTCGTTCTTCGGTT-3´。PCR 程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，共 30 个循环；72 ℃ 7 min。4 ℃保存。PCR产物通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳观察结果。3.3 结果

CSFV和PRRSV的RT-PCR检测以及PRV PCR检测发现，在该病料中出现CSFV核酸目的条带和清晰的PRV目的条带，而未出现PRRSV核酸目的条带。PCV2 PCR检测和SIV RT-PCR检测发现，该病料中PCV2核酸出现目的条带（图17-A），而SIV没有出现目的条带（图17-B）

4 确诊结果

根据流行病学、临床症状及病理剖检，初步诊断临沂该病例为PRV、CSFV、PCV2和SIV的混合感染。通过PCR检测，发现PRV和PCV2阳性；通过RT-PCR检测，发现CSFV阳性，PRRSV和SIV阴性。最后该病例确诊为PRV、CSFV和PCV2的混合感染。

图17 PCR扩增产物电泳结果

5 病因分析

该猪场仅按程序给母猪注射了PR疫苗，而对育肥猪没有进行PR和PCVD免疫接种。这可能是发生混合感染的主要原因。经询问畜主得知，该猪场饲养了3只可自由出入的家犬。因猪场封闭不严，还经常有外来犬只和野猫出入，并且场内鼠害成灾。该病例的PRV感染是否与这些犬只、野猫和老鼠携带的PRV有关[6]，需进一步对犬、猫和鼠携带病毒情况进行检测。对育肥猪，虽然注射了CSF疫苗，但由于没有进行PR和PCVD免疫，所以猪只比较容易感染PRV和PCV2。这2种病毒均为免疫抑制类病原，对CSF疫苗免疫会产生一定的抑制作用，从而影响了CSF的免疫效果[7]。

6 防控措施

6.1 PR防控

当前流行毒株为变异毒株，且致病性较之前更强，抗原性也发生了一定变异，因此现有疫苗不能对其提供完全的免疫保护[8]。但实践证明，选用合适的疫苗和免疫程序会取得较好的防治效果。建议选用伪狂犬病A毒株疫苗或HB-98毒株双基因缺失疫苗[9]。此外需注意，PRV能感染各年龄段猪群。猪群一旦感染可长期带毒并排毒，而隐性感染猪是PR的主要传染源，也是造成该病在猪场中难以根除的主要原因[10]。所以种猪场必须定期进行PRV监控，一旦发现有gE阳性种猪，要坚决淘汰。