萝卜籽粕蛋白质的组成及功能性质

赵功玲，梁新红，郭延成，孔 瑾*，李柯柯，康超娣，时翠萍

萝卜为十字花科植物，在中国已有2 700多年的栽培历史，是我国城乡居民的大众化蔬菜，其成熟的种子——萝卜籽又名莱菔子、萝白子、菜头子等。中医认为干燥成熟的萝卜籽，具有多种药理功效，可调节老化的皮肤，防止皱纹的产生，并且还具有祛斑和改善肤色等美容功效[1-3]。现代研究表明，萝卜籽中含有丰富的异硫氰酸盐，在异硫氰酸盐的种类中，莱菔素的含量最高，约占总异硫氰酸盐的60%以上，有很强的抗氧化活性[4-6]；萝卜籽中含油量可达45%，且油脂质量优良，是生产食用油的优良原料[7-9]。和许多油料种子如大豆、油菜籽等相同，萝卜籽中蛋白质的含量也很高[10]，且蛋白品质优良，有很好的应用价值及前景[11]。在我国优质植物蛋白质资源匮乏的情况下，把生产萝卜籽油的副产品——萝卜籽粕作为肥料使用，甚是可惜。

本研究拟采用碱溶酸沉法提取脱脂萝卜籽饼粕中的蛋白质，研究提取出的粗蛋白的组成、功能性质、抗氧化性能，以期揭示萝卜籽粕蛋白质的结构组成和功能特性之间的关系，为萝卜籽饼粕蛋白质的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

萝卜籽粕：亚临界萃取油脂后的残渣，经高速粉碎机粉碎，避光低温保存备用；大豆蛋白粉为市售。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 山东西亚化学工业有限公司；对氨基苯磺酸钠、盐酸萘乙二胺、NaNO2、邻二氮菲、FeSO4、H2O2、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 北京化工厂；无水乙醇、浓硫酸、硼酸、硫酸钾、硫酸铜、氢氧化钠、盐酸 天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高速粉碎机 浙江武义县屹立工具有限公司；恒温磁力搅拌器 金坛市杰瑞尔电器有限公司；LGJ-10冷冻干燥机 北京松原华兴科技发展有限公司；320P-063-Star型pH计 美国奥立龙公司；T6紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任；TDL-5-A低速大容量离心机 北京安亭科学仪器厂；L8800氨基酸分析仪日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 萝卜籽粕蛋白质的制备方法

按料液比1∶50（m/V）的比例将萝卜籽粕粉与水混合，调pH值至10，60 ℃下搅拌90 min后，11 000 r/min离心6 min，取上清液调pH值至4.5，静置30 min后，11 000 r/min离心6 min，去上清液，冷冻干燥沉淀，获得干燥蛋白质粉。在此提取条件下，萝卜籽粕中蛋白质提取率可达80.2%，蛋白质纯度为89.5%。

1.3.2 萝卜籽粕蛋白组分分离方法

采用Osborne法[12-13]分离蛋白质组分。取10 g萝卜籽粕蛋白质，依次用蒸馏水、3% NaCl溶液、70%乙醇溶液和0.2% NaOH溶液分别提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。

1.3.2.1 清蛋白的提取

准确快速称取一定量的萝卜籽粕蛋白质于预冷的研钵中，加少量蒸馏水和石英砂研磨成匀浆，用10 倍体积的蒸馏水分几次将匀浆液转移至三角瓶中，置于磁力搅拌器上低温搅拌提取1 h，4 ℃、11 000 r/min离心10 min，残渣用相同的方法重复提取2 次。合并上清液，调pH值至4.5，以下按1.3.1节中方法制备干燥清蛋白粉，并称质量。

1.3.2.2 球蛋白的提取

用3% NaCl溶液作溶剂，按照1.3.1节中方法，制取提取清蛋白后残渣中的球蛋白，称质量。

1.3.2.3 醇溶蛋白的提取

用70%乙醇溶液作溶剂，按照1.3.1节中方法，制取提取球蛋白后的残渣中的醇溶蛋白，称质量。

1.3.2.4 谷蛋白的提取

用0.2% NaOH溶液作溶剂，按照1.3.1节中方法，制取提取醇溶蛋白后的残渣中的谷蛋白，称质量。以提取出的4 种蛋白为总蛋白质量，分别计算谷蛋白、清蛋白、醇溶蛋白及球蛋白占萝卜籽粕蛋白质的百分比。

1.3.3 蛋白质含量的测定方法

参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》的方法，采用凯氏定氮法测定蛋白质的含量，蛋白质换算系数取6.25。

1.3.4 蛋白质氨基酸组成测定方法及蛋白质营养价值评价

用氨基酸自动分析仪，按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》方法测定氨基酸含量。色氨酸按照NY/T 57—1987《谷物籽粒色氨酸测定法》方法测定。

蛋白质营养价值评价：采用FAO/WHO氨基酸评分法（1973）评价[14]。

按照公式（1）计算出8 种必需氨基酸的评分（amino acid score，AAS），以最低分记为该蛋白质的AAS。

1.3.5 蛋白质的功能性质分析

[15-16]，测定蛋白质的溶解性、水合能力、吸油能力、乳化性（emulsifying activity index，EAI）、乳化稳定性（emulsifying stability index，ESI）、起泡性和泡沫稳定性。

1.3.5.1 溶解性的测定

准确称取1.0 g萝卜籽粕蛋白质，加入50 mL蒸馏水，室温下搅拌40 min，使蛋白质充分溶解，然后11 000 r/min离心15 min，取上清液。凯氏定氮法测定上清液中蛋白质量。按式（2）计算蛋白质样品的溶解性。

以大豆蛋白替代萝卜籽粕蛋白质，做相同实验，加以比较。

1.3.5.2 水合能力的测定

准确称取3.0 g萝卜籽粕蛋白于100 mL的烧杯中，加入30 mL水搅拌1 h，使之充分吸水后移至50 mL的离心管中，11 000 r/min离心20 min，去上清液，称质量。按公式（3）计算水合能力。

式中：m为萝卜籽粕蛋白质量/g；m1为吸水前萝卜籽粕蛋白和离心管总质量/g；m2为吸水后萝卜籽粕蛋白和离心管总质量/g。

以大豆蛋白替代萝卜籽粕蛋白质，做相同实验。

1.3.5.3 吸油能力的测定

准确称取5.0 g萝卜籽粕蛋白于已经称质量的离心管中，加入30 mL的一级大豆油，振荡2 min，置于60 ℃的水浴锅中保温30 min，使之充分吸油，11 000 r/min离心20 min后，将离心管上层的油全部除去，称质量。按式（4）计算蛋白质样品的吸油能力。

式中：m为萝卜籽粕蛋白质量/g；m1为吸油前萝卜籽粕蛋白质和离心管总质量/g；m2为吸油后萝卜籽粕蛋白质和离心管质量/g。

以大豆蛋白替代萝卜籽粕蛋白，做相同实验。

1.3.5.4 EAI与ESI的测定

取2 g的萝卜籽粕蛋白溶于40 mL 0.05 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，然后与40 mL一级大豆油混合，在10 000 r/min搅拌机中搅拌3 min，形成均一的乳化液后，立即用移液管从底部取1.0 mL该乳化液，加入20 mL 0.1%的SDS溶液，快速摇匀后在500 nm波长处测定吸光度，记为A0（以SDS溶液为空白），将乳化液静置30 min后，从底部取1.0 mL，同样稀释、比色，记录吸光度A30。按式（5）、（6）计算蛋白样品的EAI及ESI。

式中：m为萝卜籽粕蛋白质量/mg；φ为油相所占的体积分数（5.66%）。

以大豆蛋白替代萝卜籽粕蛋白质，做相同实验。

1.3.5.5 起泡性和泡沫稳定性的测定

准确称取1.0 g萝卜籽粕蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，调pH值至7.0，然后在8 000 r/min搅拌机中均质2 min，快速倒入500 mL量筒中，在室温下记录泡沫总体积V0/mL，静置30 min后记录泡沫总体积V30/mL。然后按式（7）、（8）计算萝卜籽粕蛋白的起泡性和泡沫稳定性。

以大豆蛋白替代萝卜籽粕蛋白，做相同实验。

1.3.6 萝卜籽粕蛋白体外抗氧化活性测定

1.3.6.1 萝卜籽粕蛋白质清除DPPH自由基活性测定

取不同含量的萝卜籽粕蛋白质溶液3.0 mL于试管中，分别加入0.6 mL的0.4 mmol/L DPPH溶液，再加6.0 mL蒸馏水。混匀反应体系，置于黑暗中反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度A1；将不同含量的萝卜籽粕蛋白质溶液与无水乙醇等体积混合于试管中，摇匀，于黑暗处反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度A2；再将DPPH与蒸馏水等体积混合，测517 nm波长处的吸光度A0；以蒸馏水和无水乙醇的等体积混合溶液作空白用于仪器调零，每个实验做3 次平行实验，按式（9）计算萝卜籽粕蛋白质对DPPH自由基的清除率。

在反应体系中依次加入1 mL 0.2%亚硝酸钠标准使用液，加入蛋白质液1 mL，置于37 ℃水浴锅中10 min后取出，分别加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液，充分混匀后，反应3 min，再加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，反应15 min后，在538 nm波长处测定溶液的吸光度A1；同时做空白实验，测定吸光度A0；每个实验做3 次平行实验，按式（10）计算萝卜籽粕蛋白质对NO2-的清除率。

1.3.6.3 萝卜籽粕蛋白质清除H2O2活性测定

取不同浓度蛋白溶液2.0 mL于试管中，分别加入4.8 mL磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）和1.2 mL 40 mmol/L H2O2溶液，混匀，于室温下放置10 min，230 nm波长处吸光度A1。以蒸馏水替代样品做相同实验，吸光度A0。以蒸馏水替代H2O2和样品做相同实验，吸光度A2。每个实验做3 次平行实验。按式（11）计算萝卜籽粕蛋白质对H2O2的清除率。

1.3.6.4 萝卜籽粕蛋白质清除·OH活性测定

在反应体系中依次加入1 mL 0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液，1.5 mL 150 mmol/L（pH 7.5）的磷酸盐缓冲液，充分混匀后，再加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液，立即摇匀，再向反应体系中加入不同浓度的蛋白质溶液1 mL，均匀后，加入1 mL 0.01%的H2O2溶液，混匀后37℃反应30 min，于536 nm波长处测吸光度A2。以等体积蒸馏水代替蛋白质样品做相同实验，测定吸光度A1。以等体积蒸馏水代替蛋白质和H2O2溶液做相同实验，测定吸光度A0。重复上述实验3 次，按公式（12）计算萝卜籽粕蛋白质对·OH的清除率。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 萝卜籽粕蛋白组分组成

萝卜籽粕蛋白主要以球蛋白、谷蛋白和清蛋白为主，分别占总蛋白质量的44%、33%、21%，醇溶蛋白含量很少，只占总蛋白质的2%。Ikeda等[20]研究认为，球蛋白、谷蛋白对胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感，属易消化蛋白，萝卜籽粕蛋白中的球蛋白和谷蛋白占总蛋白质量的77%，预示萝卜籽粕蛋白易被人体消化吸收。醇溶蛋白和谷蛋白是构成面筋蛋白的主要成分，它们在萝卜籽粕蛋白中的比例只有35%，在一定程度上会制约萝卜籽粕蛋白的食品加工特性。

2.2 萝卜籽粕蛋白氨基酸组成及营养价值评价

表1 萝卜籽粕蛋白的氨基酸组成及含量Table 1 Amino acid composition of radish seed meal protein isolate

从表1可以看出，萝卜籽粕蛋白含18 种氨基酸。功能性氨基酸中的谷氨酸含量最高，为157 mg/g，其次是精氨酸、天冬氨酸和亮氨酸，分别为70、62、61 mg/g，再次是赖氨酸、甘氨酸、脯氨酸，分别为49、49、47 mg/g。必需氨基酸含量（342 mg/g）占氨基酸总量（798 mg/g）的43%，必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值为0.75，接近或超过FAO/ WHO建议的40%和0.6[14]。亲水性氨基酸总量为518 mg/g，远大于疏水基氨基酸总量（280 mg/g），有利于在食品工业中应用。根据文献[21-22]，天冬氨酸和谷氨酸都有较强的抗氧化能力，另一些氨基酸，如脯氨酸、精氨酸等也具有一定的抗氧化能力，而在萝卜籽粕蛋白中，这些氨基酸的含量很高，预示萝卜籽粕蛋白可能具有很好的抗氧化能力。

以FAO/WHO模式为参考，根据公式（1）及表1计算出的萝卜籽粕蛋白的AAS值见表2。与大豆蛋白相似，萝卜籽粕蛋白中的第一限制氨基酸为蛋氨酸，其AAS值为57，而大豆蛋白为51。对于一种蛋白质来说，若仅从化学的角度评价其营养价值，一般AAS值越高，说明其营养价值越高，可以认为萝卜籽粕蛋白的营养价值稍高于大豆蛋白。还可以看出，除蛋氨酸外，萝卜籽粕蛋白中的其他AAS值都在80～90之间，说明了氨基酸之间的配比较平衡，有利于人体利用。而大豆蛋白的其他AAS值在75～120之间，较萝卜籽粕蛋白稍显不平衡。也再一次说明，萝卜籽粕蛋白的营养价值稍高于大豆蛋白。当然，综合评价两种蛋白的营养价值需要多种指标，有望在今后的研究中完善。

表2 萝卜籽粕蛋白质AASTable 2 AAS of radish seed meal protein isolate

2.3 蛋白质的功能性质

表3 萝卜籽粕蛋白的功能性质Table 3 Functional properties in radish seed meal protein isolate

由表3可知，萝卜籽粕蛋白的溶解性和水合能力分别为（38.55±0.38）%和（3.78±0.36）g/g，高于大豆蛋白，可能与萝卜籽粕蛋白的亲水性基团的数量较多有关。蛋白质的起泡能力和稳定性取决于其溶解性，萝卜籽粕蛋白的高溶解性，已经决定了其良好的起泡性和泡沫稳定[25-26]；萝卜籽粕蛋白的起泡性为（115.00±1.97）%，泡沫稳定性为（56.00±0.46）%，均高于大豆蛋白，也验证了这一理论。

萝卜籽粕蛋白的EAI为（29.12±0.29）cm2/mg，ESI为（4.83±0.74）min，与大豆蛋白相比，萝卜籽粕蛋白的EAI及ESI都较大豆蛋白好，在食品工业的应用中，萝卜籽粕蛋白应具有更高的价值[27]。萝卜籽粕蛋白的吸油能力为（1.84±0.11）g/g，稍低于大豆蛋白。

2.4 萝卜籽粕蛋白质的抗氧化能力

由图1可知，萝卜籽粕粗蛋白及其4 种蛋白组分对DPPH自由基、•OH、NO2-、H2O2都有一定的清除能力，且随蛋白质含量的升高，清除率也随之上升。其中，对DPPH自由基的清除能力按强弱排序依次为清蛋白＞粗蛋白、醇溶蛋白＞球蛋白＞谷蛋白；对·OH、NO2-、H2O2的清除率按强弱排序依次为谷蛋白＞粗蛋白＞球蛋白＞清蛋白＞醇溶蛋白。

图1 萝卜籽粕蛋白对DPPH自由基（A）、•OH（B）、（C）、H2O2（D）的清除率Fig. 1 Scavenging effects of radish seed protein isolate on DPPH free radicals (A), ·OH (B), (C), H2O2 (D)

由图1A可知，在蛋白质含量为0.14 mg/g时，清蛋白对DPPH自由基的清除率可达（77.2±1.7）%，粗蛋白、醇溶蛋白、球蛋白分别仅为（31.8±1.7）%、（27.4±2.0）%和（22.4±1.8）%，谷蛋白只有（6.1±1.4）%。粗蛋白清除DPPH自由基的能力差于清蛋白，与其中的谷蛋白和球蛋白占比例较大，而清除DPPH自由基的能力较差有关。由图1B可知，醇溶蛋白对•OH的清除能力远低于其他4 种蛋白，在最大蛋白质含量0.14 mg/g处，醇溶蛋白对•OH的清除率只有（46.4±2.1）%，而清蛋白为（88.5±1.8）%，球蛋白为（92.4±2.2）%，谷蛋白与粗蛋白为100%。图1C显示，清蛋白和醇溶蛋白对NO2-的清除能力相近，但远低于其他3 种蛋白，在最大蛋白质含量0.14 mg/g，清蛋白和醇溶蛋白对的清除率分别只有（35.4±1.4）%和（32.5±1.9）%，而球蛋白、粗蛋白、谷蛋白分别为（72.3±1.5）%、（80.5±1.6）%和（85.3±2.0）%。由图1D可知，在最大蛋白质含量0.14 mg/g，醇溶蛋白对H2O2的清除率远低于其他4 种蛋白，醇溶蛋白对H2O2的清除率只有（44.4±2.0）%，而清蛋白、球蛋白、粗蛋白、谷蛋白分别为（76.9±2.1）%、（83.2±1.7）%、（86.1±2.2）%和（96.4±1.6）%。

相同蛋白含量下，粗蛋白、谷蛋白、球蛋白对•OH、H2O2、、DPPH自由基的清除有相同的规律，清除率由大到小分别为•OH、H2O2、DPPH自由基；粗蛋白、谷蛋白、球蛋白对DPPH自由基的清除率远低于对•OH、H2O2、NO2-的清除率。清蛋白清除•OH、H2O2、、DPPH自由基的能力中，对•OH的清除能力最强，清除的能力最差，清除H2O2、DPPH自由基的能力相近。醇溶蛋白清除•OH、H2O2、、DPPH自由基的能力由大到小分别为H2O2、•OH、、DPPH自由基，由于在最大含量0.14 mg/g处，对H2O2的清除率只有（44.4±2.0）%，可以认为，萝卜籽粕蛋白的4 种组分中，醇溶蛋白的抗氧化能力最差。萝卜籽粕蛋白蛋比菜籽粕蛋白[28]、荞麦蛋白[29]、铁棍山药蛋白质[30]具有更好的清除DPPH自由基、•OH的能力。

3 结 论

萝卜籽粕蛋白的组成中球蛋白、谷蛋白、清蛋白和醇溶蛋白分别占总蛋白质的44%、33%、21%和2%。萝卜籽粕蛋白中含18 种氨基酸，其中谷氨酸含量最高，其次是精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、赖氨酸等，第一限制氨基酸为蛋氨酸，AAS评分值为57；必需氨基酸的构成比及AAS评分都优于大豆蛋白。与大豆蛋白相比，萝卜籽粕蛋白具有很好的溶解性、水合能力、起泡性、泡沫稳、EAI和ESI，吸油能力稍差于大豆蛋白。萝卜籽粕蛋白质及其四组分对DPPH自由基、•OH、及H2O2都具有清除能力。粗蛋白、谷蛋白、球蛋白对•OH、及H2O2有很好的清除能力。清蛋白对•OH、H2O2、DPPH自由基有较好的清除能力。4 种蛋白质中，醇溶蛋白的抗氧化能力最差。如今，人们应用较多的优质植物蛋白源只有大豆蛋白，显得很单一。由于萝卜籽粕蛋白营养价值高，并且有很好的功能性质及一定的抗氧化能力，因此萝卜籽粕蛋白具有很高的开发价值。

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