胃液长链非编码RNA RMRP的检测及其临床价值分析

周善学 朱春霞 陆蓉丹 邵永富 叶国良

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是 一类转录本长度＞200个核苷酸并且不具备蛋白质编码功能的RNA分子。LncRNA以RNA的形式在表观遗传学水平、转录水平和转录后水平等多个层面调控基因的表达，是重要的基因表达调控元件[1-2]，参与染色质重构、细胞分化、蛋白转运、mRNA选择性剪切等过程[3-4]。在前期研究中，本课题组采用芯片分析了胃癌lncRNA表达谱的差异，发现线粒体RNA处理核糖核酸内切酶RNA组份（RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，RMRP）在胃癌组织中表达水平显著改变。本研究拟在前期研究的基础上，进一步检测RMRP在不同患者胃液中的水平及变化规律，结合临床病理因素探讨胃液RMRP作为胃癌筛查标志物的临床价值，并通过联合比较检测胃液RMRP、癌胚抗原（CEA）和血清CEA在早期胃癌和进展期胃癌中的阳性率，以期为胃癌早期筛查提供新思路。

1 材料和方法

1.1 标本来源 45例正常或轻度胃炎患者胃液、30例胃溃疡患者胃液、16例慢性萎缩性胃炎患者胃液和39例胃癌（7例早期胃癌、32例进展期胃癌）患者胃液标本取自2012年9月至2015年1月在本院进行胃镜检查的患者，且均经病理检查证实。所有患者胃镜检查前均空腹8h，检查前2周内未接受任何药物治疗。上述新鲜胃液标本采集后保存在-80℃冰箱中备用。肿瘤病理类型参照WHO的胃癌病理学分类标准，并根据美国癌症联合委员会（AJCC）胃癌TNM分期（2010年第7版）进行TNM分期。本研究经宁波大学医学研究伦理道德委员会批准和患者知情同意。

1.2 总RNA的提取 经Trizol LS试剂（美国Invitrogen公司）抽提胃液总RNA，DEPC水复溶后，用核酸蛋白分析仪测定总RNA浓度，根据总RNA A260/A280比值和1.5%非变性琼脂糖凝胶电泳RNA条带完整性鉴定总RNA质量。取10μl总RNA加入GoScript逆转录试剂盒（美国Promega公司）进行逆转录反应，得到cDNA溶液，加80μl DEPC稀释后，保存于-20℃冰箱。

1.3 胃液RMRP检测 采用miScript SYBR Green PCR检测试剂盒（德国Qiagen公司）对上步的5μl cDNA溶液进行qRT-PCR（美国Stratagene公司），内参GAPDH mRNA引物序列如下：上游为5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游为 5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′；RMRP引物序列如下：上游为5′-ACTCCAAAGTCCGCCAAGA-3′，下游为 5′-TGCGTAACTAGAGGGAGCTGAC-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反应体系为：1μl RMRP特异性扩增上下游引物或GAPDH上下游引物，12.5μl Go-Taq?qPCR Master Mix，5.5μl无 RNase水和 5μl cDNA。qRT-PCR反应条件为：95℃预变性5min；然后94℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环。所有样本做3个复孔。通过对胃液RMRP的PCR产物克隆测序明确了胃液RMRP的存在，采用qRT-PCR检测胃液RMRP的特异性。本研究采用ΔCt法分析目的RMRP的相对表达水平。ΔCt=CtRMRP-CtGAPDH。ΔCt数值越大，则基因表达水平越低。

1.4 胃液和血清CEA水平检测 采用ELISA法检测胃液和血清CEA水平。所有操作过程严格按照CEA定量检测试剂盒（广州健仑生物科技有限公司）说明书进行。本研究中胃液和血清CEA定量检测＞10ng/ml视为阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用方差分析。计数资料组间比较采用Fisher确切概率法或χ2检验。绘图由GraphPad Prism v5.0软件完成。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常或轻度胃炎、胃溃疡、慢性萎缩性胃炎和胃癌患者胃液RMRP水平比较 相对于正常或轻度胃炎患者，胃溃疡患者胃液RMRP水平无明显变化（P＞0.05），而慢性萎缩性胃炎患者胃液RMRP水平明显降低，胃癌患者胃液RMRP水平显著升高（均P＜0.01），见表1。

表1 正常或轻度胃炎、胃溃疡、慢性萎缩性胃炎和胃癌患者胃液RMRP水平比较

2.2 胃液RMRP水平与胃癌患者临床病理因素关系分析 胃癌患者胃液RMRP水平与患者年龄、幽门螺杆菌感染情况均有关（均P＜0.05），而与性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤位置、血清CEA水平、糖类抗原（CA）19-9水平等因素均无关（均P＞0.05），见表2。同时，笔者构建了胃液RMRP的ROC曲线，AUC为0.699；当其截断值为-0.592时，胃液RMRP的灵敏度和特异度分别为0.56 和 0.75，见图 1。

2.3 不同标志物筛查早期胃癌和进展期胃癌的阳性率比较 通过联合检测血清或胃液CEA和胃液RMRP，笔者分别检测了7例早期胃癌和32例进展期胃癌的阳性率。结果显示，胃液RMRP联合血清或胃液CEA筛查胃癌的效果明显优于传统肿瘤标志物血清CEA（均P＜0.05），见表 3。

表2 胃液RMRP水平与胃癌患者临床病理因素分析

3 讨论

图1 胃液RMRP水平诊断胃癌的ROC曲线

胃癌是世界上最常见的肿瘤之一，占肿瘤死亡原因的第3位，每年死于胃癌的人数约占全球死亡人数的10.4%[5]。因胃癌的发生、发展是一个多因素、多阶段、多步骤的过程，涉及到大量的基因参与及复杂的网络调控，胃癌的病理生理机制迄今尚未完全阐明，其早期诊断及治疗受到极大的限制[6]。研究表明lncRNA参与胃癌的发生、发展过程，并通过复杂的分子机制对胃癌的侵袭和迁移起着极为重要的作用[7-8]。

RMRP定位于人类染色体9p13.3，全长277个核苷酸，由10个不同的亚基及单个RNA分子组成[9-10]。研究发现，RMRP绝大部分存在于细胞核与核仁，仍有小部分存在于线粒体内，可在小鼠及人类组织中表达[11-12]。在线粒体内，RMRP充当核酸内切酶角色，能够劈开一段从DNA复制起始点合成的RNA产生一条RNA引物，供线粒体DNA领头链合成用。而在核仁，RMRP通过劈开5.8S rRNA前体上最后的短RNA片段，产生成熟的功能性5.8S rRNA分子[13]。此外，RMRP还能与端粒酶相关逆转录酶形成复合物而展示出RNA依赖的RNA活性[14]。

RMRP在核糖体合成、细胞周期调控和线粒体DNA的复制中均发挥一定的作用[9]。在肿瘤领域，研究发现RMRP的异常表达可导致肿瘤的发生。Shao等[6]发现胃组织RMRP表达水平只在胃癌前病变阶段和胃癌阶段显著降低，显示它是胃癌相关性lncRNA。Meng等[15]发现RMRP在肺腺癌组织中高表达，其过表达可促进细胞增殖、克隆形成和侵袭，通过调控miR-26发挥致癌活性。Park等[9]研究发现RMRP在许多恶性肿瘤细胞及结直肠癌组织、乳腺癌组织中高表达。由此可见，RMRP是一个潜在的肿瘤检测及诊治新靶点。

本课题组通过lncRNA芯片检测了胃癌组织及其配对癌旁组织lncRNA表达谱的差异[16]，发现RMRP荧光强度大、差异倍数高，在组织中的变化趋势一致，以此作为研究对象，检测其在胃液中的表达水平，探究其临床意义。本实验通过qRT-PCR验证130例患者胃液中RMRP的实际表达情况，发现相对于正常或轻度胃炎患者，胃溃疡患者胃液RMRP水平无明显变化，而慢性萎缩性胃炎患者胃液RMRP水平显著降低，胃癌患者胃液RMRP水平显著升高，证实了RMRP与胃癌的相关性，具有作为胃癌筛查标志物的潜质。本课题组前期研究发现胃组织RMRP表达水平只在胃癌前病变阶段和胃癌阶段显著降低[6]，而胃液RMRP水平在胃癌患者中却反常性显著升高。由此推测，胃黏膜细胞癌变时细胞RMRP主动分泌加强，而检测胃液RMRP水平可进一步提高胃癌检出率。

表3 不同标志物筛查早期胃癌和进展期胃癌的阳性率比较[例（%）]

幽门螺杆菌感染是引起胃癌进展的主要原因，与宿主炎症因子密切相关，在这一过程中，微环境的改变可能导致胃癌细胞发生随机突变，从而导致胃癌的发生[17-18]。结合胃癌患者临床病理因素，进一步发现了RMRP水平与患者年龄、幽门螺杆菌感染密切相关。由此推测，RMRP可能在胃癌的起始阶段发挥炎症作用，通过以RNA的形式在表观遗传学水平、转录水平和转录后水平等多个层面调控基因的表达进一步促进胃癌的发生。

胃液来源较为单一，其反映上消化道肿瘤具有显著优势。通过构建胃液RMRP的ROC曲线，发现AUC为0.699，结合其灵敏度和特异度分别为0.56和0.75，有较高的临床诊断价值。早期诊断是降低胃癌病死率的关键一环[19]，肿瘤标志物联合检测是提高胃癌检出率的重要手段。通过联合血清或胃液CEA和胃液RMRP，检测了早期胃癌和进展期胃癌的阳性率，发现胃液RMRP联合血清或胃液CEA筛查胃癌的效果明显优于传统肿瘤标志物血清CEA，联合检测胃液RMRP、血清CEA和胃液CEA可提高胃癌检出率。

本研究证实了胃癌相关lncRNA的存在，并进一步分析了胃癌相关lncRNA RMRP在胃液中的临床意义。胃液RMRP作为潜在的早期胃癌筛查标志物，为临床诊治胃癌研究提供了新的思路。

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