Cocl2诱发急性化学缺氧对非酒精性脂肪肝小鼠的影响

张学松 张谢 叶桦 宋毓飞

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种常见的慢性肝脏疾病，其发病机制复杂，通常为遗传、环境、代谢、应激作用的结果[1－2]。早期研究显示，NAFLD与机体内胰岛素耐受性密切相关，同时西方饮食、高饱和脂肪、高果糖在NAFLD发病中也起到了重要的作用，过多的TG在肝细胞中堆积是其重要的发病机制之一[3]。肝脏脂肪化、血管受压等导致肝组织缺血、缺氧，可进一步引起肝细胞变性坏死、肝脏纤维组织增生，从而引起组织的代谢、功能和形态结构发生异常[4]。成纤维细胞生长因子21（FGF21）是近年来新发现的、由肝脏分泌的一类内分泌样生长因子，通过调节机体的葡萄糖、脂质代谢，从而在人体中发挥着重要作用[5]。前期研究显示，FGF21在NAFLD患者体内明显上调，同时与肝脏内脂肪含量高度相关[6]，但FGF21在NAFLD小鼠体内的具体作用机制尚未明确。本研究采用高脂饮食建立NAFLD小鼠模型，同时采用化学缺氧剂二氯化钴（Cocl2）进行诱导，观察急性缺氧对NAFLD小鼠的影响，并初步探讨FGF21的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 实验动物 雄性C57BL/6小鼠30只，SPF级，体重18～22g，由温州医科大学动物实验中心提供[合格证号：SCXK（浙）2015－0001]，在温州医科大学动物实验中心分笼饲养。

1.1.2 主要试剂 小鼠FGF21 ELISA试剂盒（广州百为生物技术有限公司）；三色染色试剂盒（上海源叶生物技术有限公司）；Cocl2（美国sigma公司）；Trizol（美国Invitrogen公司，货号：15596018）；M－MLV 逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司，货号：18080400）；血糖试剂盒（宁波普瑞柏生物技术有限公司，货号：GL8360）；TG试剂盒（美国 Beckman Coulter公司，货号：OSR61118）；TC试剂盒（美国Beckman Coulter公司，货号：OSR6216E）；ALT试剂盒（美国Beckman Coulter公司，货号：OSR6107）；Masson三色染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1340）；c－Jun 氨基末端激酶（JNK）抗体（美国R&D公司，货号：AF1387）；p－JNK抗体（美国R&D 公司，货号：AF1205）、FGF21抗体（美国 santa cruz公司，货号：sc－81946）、X－盒－结合蛋白－1（XBP－1）抗体（美国 santa cruz公司，货号：sc－7160）、GAPDH 抗体（美国 santa cruz公司，货号：sc－47724）、鼠抗兔二抗（美国santa cruz公司，货号：sc－2358）驴抗兔二抗（美国santa cruz公司，货号：sc－2315）。

1.1.3 主要仪器 全自动生化分析仪（AU5400型，美国Beckman Coulter公司）；显微镜（ECLPSE 80i型，日本Nikon公司）；高速冷冻离心机（micro21R型，美国Thermo Fisher公司）；超纯水（Direct－Q3 型，美国 Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 将30只实验小鼠分为正常饮食组（control组，给予基础饲料喂养8周）、高脂饮食组（HFD组，给予高脂饲料喂养8周，热量比为碳水化合物35%+脂肪51%+蛋白质14%）、高脂饮食+Cocl2缺氧处理组（HFD+Cocl2组，给予高脂饲料喂养8周后，在小鼠腹腔注射60mg/kg的Cocl2作用24h），每组10只。经上述处理后，小鼠饥饿过夜，通过心脏穿刺的方法收集血样后处死，收集其肝脏组织。

1.2.2 血清生化指标检测 采用全自动生化分析仪检测小鼠血清中空腹血糖、TG、TC、ALT水平，采用ELISA试剂盒检测小鼠血清中FGF21含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.3 肝脏组织学染色 处死小鼠后，取各组小鼠相同部位的肝脏组织，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，5μm切片，作HE染色及三色染色。

1.2.4 Q－PCR法检测肝脏相关基因的表达 Trizol法提取肝脏组织中的RNA，取1μg的RNA进行逆转成cDNA后进行扩增，同时设定RN18s作为内参对照，mFGF21 上游引物为 5′－CTGGGGGTCTACCAAGCATA－3′，下游引物为 5′－CACCCAGGATTTGAATGACC－3′。

1.2.5 Western bolt法检测相关蛋白的表达 按蛋白裂解液说明书抽提蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，蛋白变性后行SDS－PAGE电泳，湿转法到PVDF膜上，加3%BSA封闭液，室温下孵育 2h，加FGF21、p－JNK、JNK、XBP－1、GAPDH 一抗（1∶1 000），4℃封闭过夜，弃一抗，Tris－HCl缓冲盐溶液+吐温（TBST）洗 3 遍。加 1∶10 000的二抗，室温孵育2h后，弃二抗，TBST洗3遍。增强化学荧光发光法显影，曝光。

1.3 统计学处理 应用GraphPad 5.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高脂饮食及Cocl2处理后对小鼠体征指数及代谢的影响 HFD组小鼠喂养8周后，体重、肝脏重量、肝脏体重比及血清中空腹血糖、TC均较control组明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1a－c。Cocl2处理后小鼠体重、肝脏重量、肝脏体重比及血清中空腹血糖、TG、TC均高于control组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；其中血清中TG高于HFD组（P＜0.05），见图1d-f。

图1 3组小鼠体征指数及代谢指标的比较（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 高脂饮食及Cocl2处理后对小鼠肝脏组织形态学的影响 HE染色结果：与control组比较，HFD组、HFD+Cocl2组小鼠肝脏内脂质大量堆积，可见大量脂肪空泡，见图2a-c。三色染色结果：与control组比较，HFD组、HFD+Cocl2组小鼠肝脏血管腔内纤维化均明显增多，见图 2d-f。

图 2 3 组小鼠肝脏组织形态学比较（a、d：control组；b、e：HFD 组；c、f：HFD+Cocl2组）

2.3 高脂饮食及Cocl2处理后对小鼠肝脏损伤及炎症因子表达的影响 与control组比较，HFD组、HFD+Cocl2组小鼠血清中肝脏损伤因子ALT水平、炎症因子基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）mRNA表达水平均明显升高（均P＜0.05），且HFD+Cocl2组均高于HFD组（均 P＜0.05），见图 3a-b。control组、HFD 组、HFD+Cocl2组小鼠缺氧诱导因子1α（HIF-1α）mRNA表达水平两两比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图3c。

2.4 高脂饮食及Cocl2处理后小鼠FGF21表达的影响 ELISA结果显示，与control组比较，HFD组小鼠血清FGF21水平升高，经Cocl2处理后血清FGF21水平进一步升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图4a；肝脏组织FGF21 mRNA及蛋白表达变化与血清水平趋势相同，见4b-c。

2.5 高脂饮食及Cocl2处理小鼠后对内质网应激信号通路的影响 Western blot结果显示，与control组比较，HFD组p-JNK及XBP-1蛋白表达明显增多，HFD+Co－ cl2组表达进一步增强，见图5。

图3 3组小鼠血清ALT及肝脏组织TIMP-1、HIF-1α mRNA表达水平的比较（*P＜0.05，**P＜0.01）

图4 3组小鼠血清FGF21及肝脏组织FGF21 mRNA表达水平及蛋白电泳图的比较（*P＜0.05，**P＜0.01）

图5 3组小鼠肝脏JNK、XBP-1信号通路的电泳图比较

3 讨论

NAFLD的发病机制存在较多争议，目前普遍被接受的是“多次打击”学说，涉及到脂肪毒性、氧化应激、内质网压力、慢性炎症状态和线粒体功能障碍等[7-8]。肝脏细胞内质网应激诱导的脂类代谢障碍被认为是NAFLD发病机制的重要基础。低氧环境被认为是内质网应激的一个重要诱导因素，但关于诱导的机制目前仍未明确[9-10]。本研究结果显示，与control组比较，HFD组、HFD+Cocl2组小鼠炎症因子TIMP-1 mRNA表达均明显上调，内质网应激相关蛋白p-JNK、XBP-1表达均明显增加，但HIF-1α mRNA表达不明显，可能与缺氧时间较短有关。因此，笔者推测体内的炎症诱导其内质网应激，而内质网应激反应可能是缺氧诱导脂类代谢障碍的另一条调控途径，但具体作用机制有待进一步探索。

FGF21是FGFs家族中目前发现的唯一没有促有丝分裂的基因，具有内分泌因子的功能，同时参与机体物质代谢，并维持机体脂肪和糖代谢的平衡[11-12]。Kharitomenkov等[13]证实FGF21在灵长类动物中具有代谢调控功能，同时还发现FGF21具有调控脂蛋白的功能，在治疗动脉粥样硬化中具有重要作用。目前有文献报道FGF21与肝脏疾病存在一定关系：Gaemers等[14]的动物实验结果表明高脂流体饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏中FGF21 mRNA明显增高；Li等[15]临床研究报道肝损伤患者外周血中FGF21水平明显升高，与AST、谷氨酰转肽酶均相关。本研究结果表明HFD组小鼠呈现出明显的脂肪肝病变状况，血清FGF21水平、肝脏组织FGF21 mRNA及蛋白表达均明显升高；提示急性缺氧加重了NAFLD小鼠的肝脏损伤，进一步上调了FGF21的表达。因此，笔者推测小鼠体内FGF21水平升高对机体可能是一种反馈性的保护作用，它与小鼠肝脏损伤严重程度密切相关。

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