胰酶激活的E型肉毒毒素及其类毒素免疫原性研究

段丽娟，李育合，谢小荣，孟祥玉，戴于栋，金学敏，高建军



胰酶激活的E型肉毒毒素及其类毒素免疫原性研究

段丽娟，李育合，谢小荣，孟祥玉，戴于栋，金学敏，高建军

730046 兰州生物制品研究所有限责任公司血清室

胰酶激活 E 型肉毒毒素，并研究其类毒素免疫原性。

胰酶激活 E 型肉毒毒素，脱毒后制备类毒素，免疫家兔，与常规方法制备的 E 型肉毒类毒素比较免疫原性。

胰酶激活 E 型肉毒毒素的最佳条件为胰酶浓度0.5%、激活时间 45 min、pH 6.0、温度37 ℃，在此条件下可提高毒素毒力 1000 倍，但其类毒素免疫原性与常规方法无显著性差异。

胰酶激活 E 型肉毒毒素，可大幅度提高毒素毒力，但并未改变其免疫原性。

胰酶； 类毒素类； 免疫原性； E 型肉毒毒素

肉毒毒素（botulinum toxin）是由厌氧的肉毒梭菌（clostridium botulinum）在生长繁殖过程中产生的一种细菌外毒素，它能引起以运动神经麻痹症状为主的死亡率极高的中毒性疾病。肉毒梭菌及其毒素根据毒素抗原性的不同，可分为 A、B、C、D、E、F、G 七个型。其中 A、B、E 是人类罹患肉毒中毒的主要型别，F 型仅有少数几起人中毒的报道，而 G 型至今尚无致人中毒的确凿证据。C、D 型除个别病例外，主要是牲畜和禽类中毒的病原[1]。在我国，E 型肉毒中毒在青海省等青藏高原地区多有发生，中毒症状一般为视觉模糊、呼吸困难、眼睑下垂、吞咽困难及全身乏力等[2-3]。对于肉毒毒素中毒的治疗，通常用抗毒素来中和。由于抗毒素与毒素的结合具有严格的特异性，因此 E 型肉毒中毒只能用特异性的 E 型肉毒抗毒素来进行治疗。由于高品质的抗毒素依赖于免疫原性较高的抗原免疫动物后获得的高效价的免疫血浆，因此，制备高免疫原性的免疫原是提高抗毒素质量的前提条件之一。

E 型肉毒梭菌及其毒素具有与其他型别不同的生物特性与多样性[4-5]，在其生产过程中会出现毒力值较低的情况，导致免疫动物后血浆免疫效价不理想。为制备具有高免疫原性的 E 型肉毒免疫原，需探索不同方法优化其毒素、类毒素的制备过程。本实验通过加入一定量的胰酶，对毒素蛋白进行激活的方法制备 E 型肉毒毒素，脱毒后免疫动物，研究其免疫原性。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌种及培养基 实验用 E 型肉毒梭菌菌种（批号：WS-E20110901）、多价肉毒毒素诊断血清和 E 型肉毒梭菌培养基分别由本公司毒素制剂室和培养基室提供。

1.1.2 试剂与仪器 硫酸、甲醛购自国药集团化学试剂有限公司；澄清及除菌过滤滤芯购自美国 PALL 公司；电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。

1.1.3 实验动物 昆明小鼠（雄性，14 ~ 16 g，批号 20150323）、豚鼠（雄性，350 g，批号 20150305）、青紫蓝兔（雌性，2500 g，批号 2150226）均由本公司实验动物室提供，饲养环境为 18 ~ 29 ℃，相对湿度 40%~ 70%。

1.2 方法

1.2.1 E 型肉毒毒素的制备 将 E 型肉毒梭菌菌种复苏后，吸取菌液接种于 CM 培养基大管中，30 ℃厌氧培养 48 h。之后将大管的培养液接种于 CM 培养基扁瓶中，轻微振荡混匀后 30 ℃厌氧培养 24 h。最后将扁瓶培养物接种于含 CM 培养基的大立瓶中进行产毒培养，轻微振荡混匀后 30 ℃培养 5 d。

1.2.2 E 型肉毒毒素的胰酶激活及检定 胰酶激活 E 型肉毒毒素的主要影响因素为胰酶浓度、激活时间、pH、温度等条件。在本实验中将以上条件的筛选范围选定为：胰酶浓度 0%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%；激活时间为 30、45、60、90 min；pH 调为 5.0、6.0、7.0；温度为 30、35、37、40 ℃。在以上条件中用 Design Expert 软件做实验设计，通过测定胰酶激活后毒素毒力，筛选最佳实验条件。

将培养的 E 型肉毒毒素平均分为 2 份，一份批号为 201502002-1，另一份用筛选好的条件进行胰酶激活，批号为 201502002-2。

1.2.3 E 型肉毒类毒素的制备及检定 采用甲醛分段脱毒法，分别将上述两种方法制备的 E 型肉毒毒素脱毒，制备类毒素。即按原毒素的量首次缓慢加入福尔马林 0.2%，边加边摇匀，封口后置于 37 ℃脱毒7 d。再次加入 0.1% 福尔马林，37 ℃放置 7 d。根据国家药典要求进行结合力、蛋白氮（PN）、总氮（TN）、pH 测定、脱毒检查及毒性逆转试验[6]。

1.2.4 抗原配制及家兔免疫 根据类毒素结合力的检定结果，配制免疫用抗原（蛋白含量为2.0 mg/ml）。按常规免疫程序，分别进行基础免疫和三程超免疫。胰酶激活组与非激活组各程次均注射相同免疫剂量，各程次免疫剂量见表 1。每程次在第 2 针注射后第 20 天采集左右耳缘静脉血检测免疫效价。

2 结果

2.1 肉毒毒素型特异性检查

用多价肉毒毒素诊断血清，按参考文献[7]所述方法分别对上述试验获得的毒素进行型特异性检查。检定结果（表 2）显示，两个批号的毒素均为 E 型肉毒毒素。

2.2 E 型肉毒毒素的胰酶激活条件筛选

用 Design Expert 软件对胰酶激活条件进行筛选比对，结果显示 E 型肉毒毒素的胰酶激活条件为胰酶浓度 0.5%、pH 6.0、温度 37 ℃、激活时间 45 min 时效果最佳（筛选过程实验数据略）。试验结果见表 3。

2.3 E 型肉毒毒素毒力测定

按参考文献[7]所述方法分别对 E 型肉毒毒素激活组和未激活组进行毒力测定，结果见表 4。

2.4 E 型肉毒类毒素的制备及检定

将两个批号毒素分别加适量甲醛，37 ℃脱毒，制成类毒素。两组类毒素脱毒检查和毒性逆转试验均合格。结合力、蛋白氮（PN）、总氮（TN）及 pH 测定结果见表 4。

2.5 抗原配制

根据E 型肉毒类毒素的结合力进行抗原配制，配制抗原结合力见表 4。

表 1 家兔免疫程序

表 2 肉毒毒素型特异性检查

表 3 Design Expert 试验结果

表 4 E 型肉毒毒素未激活组和激活组检测结果

2.6 家兔免疫效价结果

按《中国药典》规定方法对每程采血血样进行效价测定，每个样品检测 3次，用 SPSS 软件对两个批号的 3 个程次的平均免疫效价结果进行统计学分析，结果显示值为 0.688（表 4），说明胰酶激活组和未激活组的 E 型肉毒毒素制备的抗原免疫家兔后，免疫效价无显著性差异。

3 讨论

制备高免疫原性的免疫原来免疫动物，从而获得高效价的抗毒素免疫血浆，这对提高抗毒素产品的抗体效价与比活性是尤为重要的。因此为了获得高效价、高比活性的 E 型肉毒抗毒素，需要生产制备出高免疫原性的 E 型肉毒类毒素。

在本实验中我们从胰酶浓度（0% ~ 1.0%）、激活时间（30 ~ 90 min）、pH值（5.0 ~ 7.0）、温度（30 ~ 40 ℃）这 4 个试验因素入手，最后选定最佳试验条件为：胰酶浓度 0.5%、激活时间45 min、pH 6.0、温度 37 ℃。通过试验对比得出，以上条件下胰酶激活制备的 E 型肉毒毒素，毒力显著上升，增加了 103LD50/ml。

将胰酶激活的 E 型肉毒毒素与常规方法制备的 E 型肉毒毒素脱毒后免疫动物，结果显示免疫效价并未发生显著变化，说明胰酶激活 E 型肉毒毒素虽可以使毒素毒力大幅度提高，然而并不改变其免疫原性。E 型肉毒梭菌及其毒素具有与其他型别不同的生物特性与多样性，胰酶使其单链蛋白质上的赖氨酰键被切开，产生两条多肽链，为激活的衍生毒素，这种游离的毒性成分使得毒素毒力增强。但类毒素免疫原性的提高还需要在精制提纯抗原方面入手，通过硫酸铵盐析、酸沉淀法、柱层析法等方法来进行探索。本实验为 E 型肉毒毒素的相关研究提供了数据支持，建立了技术平台。

[1] Zhao K, Zhang YH, Li HM. Medical biological products. 2nd. Beijing: People's Medical Publishing House, 2007:702-716. (in Chinese)

赵铠, 章以浩, 李河民. 医学生物制品学. 2版. 北京: 人民卫生出版社, 2007:702-716.

[2] Jiao Y, Wang CX, Ge H, et al. Laboratory diagnosis of botulinum toxin E poisoning. J Med Pest Control, 2011, 27(8):776, 778. (in Chinese)

焦焱, 汪春翔, 葛华, 等. 一起E型肉毒毒素中毒的实验室诊断. 医学动物防制, 2011, 27(8):776, 778.

[3] Zhou HW, Chen ZY. To explore the treatment of 10 patients with type E botulism patients. Mod Prev Med, 2012, 39(4):836, 843. (in Chinese)

周浩武, 陈真英. 抢救10例E型肉毒中毒病人方法探讨. 现代预防医学, 2012, 39(4):836, 843.

[4] Hannett GE, Stone WB, Davis SW, et al. Biodiversity of clostridium botulinum type E associated with a large outbreak of botulism in wildlife from lake erie and lake ontario. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(3):1061-1068.

[5] Hyytiä E, Hielm S, Björkroth J, et al. Biodiversity of Clostridium botulinum type E strains isolated from fish and fishery products. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(5):2057-2064.

[6] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. Volume 3, 2015. Beijing: China Medical Science Press, 2015:88-89. (in Chinese)

国家药典委员会. 中华人民共和国药典. 2015年版三部. 北京: 中国医药科技出版社, 2015:88-89.

[7] Gao JJ, Zhang C, Mao XY, et al. Identification of clostridium botulinum type C and whole gene sequencing of its neurotoxin. ChinJ Biol, 2011, 24(12):1425-1429. (in Chinese)

高建军, 张超, 毛晓燕, 等. C型肉毒梭菌的鉴定及其神经毒素基因全序列测定. 中国生物制品学杂志, 2011, 24(12):1425-1429.

Immunogenicity research of the toxoid prepared from tyrisin activated botulinum toxin type E

DUAN Li-juan, LI Yu-he, XIE Xiao-rong, MENG Xiang-yu, DAI Yu-dong, JIN Xue-min, GAO Jian-jun

Author Affiliation: Lanzhou Institute of Biological Products Co.Ltd., Lanzhou 730046, China

To study and evaluation immunogenicity of the toxoid prepared from tyrisin activated botulinum toxin type E.

Tyrisin were used to activate the toxin of botulinum toxin type E. After detoxified, the rabbits were immuned with the toxoid and immunogenicity were compared with the toxoid prepared from conventional method.

The optimal conditions of trypsin activation were set as follows: 0.5% trypsin concentration, 45 min activation time, pH 6.0, at 37℃. Under these conditions, the toxicity of the tyrisin activated botulinum toxin type E could be increased by 1000times, while the immunogenicity of the toxoid had no significant difference as compared with conventional method.

The toxicity of botulinum toxin type E could be greatly improved through the process of tyrisin activation, but its immunogenicity remains unchanged.

Pancreatin; Toxoids; Immunogenicity; Botulinum toxin type E

GAO Jian-jun, Email: gao5369@163.com

高建军，Email：gao5369@163.com

2017-09-18

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.008