不同培养基对春小麦×玉米单倍体胚分化成苗的影响

王 重，樊哲儒，张跃强，李剑峰，高 新，王子霞

(1.新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐 830091；2.农业部荒漠绿洲作物生理生态与耕作重点实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】使用玉米花粉可以诱导小麦产生单倍体胚，分化后获得的单倍体植株经过加倍可以得到纯合双单倍体[1-3]，该方法与传统的杂交育种比较能够有效地缩短育种年限，而且不受基因型制约，也不会产生白化苗，育种应用潜力非常大[4-7]。但是诱导得到的单倍体胚由于胚乳发育不完全，必须经过离体培养方式进行胚拯救方可分化成苗[8, 9]，因此，选择合适的离体培养基进行分化培养对于提高单倍体植株的获得效率和加倍效率具有决定性的作用。【前人研究进展】目前广泛应用于单倍体胚离体培养的培养基有MS、B5等[10]，但不同学者的研究结果并不一致。Laurie等[2]使用1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA进行培养，幼胚能够长出嫩芽，但根系生长缓慢，Brazauskas等[11]使用2/3 B5培养基时单倍体胚再生为小麦幼苗的分化率为36. 9%，赵翠荣等[12]研究表明，无激素添加的1/2 MS培养基单倍体胚萌发率和成苗率均高于B5培养基和添加激素的1/2 MS培养基，陈新民等[9]使用1/2 MS培养基和B5培养基进行单倍体胚培养，结果表明，B5培养基的幼胚萌发率略高于1/2 MS培养基，但两者之间差异不显著，张阔等[13]研究认为改良的B5培养基对于单倍体胚的培养明显优于1/2 MS培养基，蔡东明等[14]在1/2 MS培养基中添加微量激素可使幼苗产生率达到62.05%，陈淑萍等[15]研究表明1/2 MS培养基中添加2,4-D可使单倍体幼苗生长旺盛，根系发达，生长素效果为2,4-D>IBA>IAA，高艳等[16]研究认为1/2 MS培养基中添加微量多效唑、KT、肌醇及较高浓度蔗糖能够有效促进单倍体胚的分化。【本研究切入点】单倍体胚分化是小麦双单倍体产生的重要过程，单倍体植株的获得效率以及生长健壮程度是影响后期加倍处理效率的关键因素，目前单倍体胚分化培养基的研究并无统一结论，且多以冬小麦为研究对象，针对春小麦单倍体胚分化的研究鲜见报道。研究不同培养基对春小麦×玉米单倍体胚分化成苗的影响。【拟解决的关键问题】以1/2 MS和B5为基础培养基，结合不同水平激素的添加，分析不同培养基配方对于小麦单倍体胚成苗率的影响，研究适宜新疆春小麦单倍体胚分化成苗的最佳培养基，为进一步将春小麦×玉米远缘杂交方法应用于育种实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料春小麦单倍体胚由新疆农业科学院核技术生物技术研究所提供，母本为春小麦材料XC、126H，父本分别为爆裂玉米、甜玉米、糯玉米。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

玉米材料4月上旬覆膜播种，分三期，间隔8 d，小麦材料于4月下旬分两期播种。小麦抽穗后采用常规杂交方法整穗、剪颖、去雄、套袋，待柱头呈现绒毛状时收集新鲜玉米花粉使用脱脂棉蘸取进行授粉杂交，授粉24 h后，进行第2次授粉，48 h后喷施激素，72 h重复喷施激素。授粉15 d后，将小穗剪下取回，剥出籽粒，使用70%乙醇消毒1 min，无菌水洗涤3次，再用0.1% HgCl2消毒8 min，无菌水洗涤5次，接种于培养基上暗培养7 d，胚萌发后移至正常光照下培养直至分化成苗。

1.2.2培养基配方

试验采用小麦组织培养经常使用的1/2MS和B5作为基础培养基，列出添加不同激素(2,4-D、IAA、6-BA)及激素配比的适宜新疆春小麦单倍体胚发育的培养基配方。表1

表1 培养基配方
Table 1 Medium formula

编号Medium No.培养基配方Medium components蔗糖Sucrose (g/L)琼脂Agar (g/L)pH值pH value11/2 MS3075.821/2 MS+0.1 mg/L 2,4-D3075.831/2 MS+0.1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA3075.841/2 MS+0.1 mg/L IAA+0.1 mg/L 6-BA3075.85B53075.86B5+0.1 mg/L 2,4-D3075.87B5+0.1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA3075.88B5+0.1 mg/L IAA+0.1 mg/L 6-BA3075.8

1.2.3 计算

根系数量：单倍体胚接种15 d后长度>0.5 cm根系数量。

根系最大长度：单倍体胚接种15 d后最长根系长度。

成苗率=幼苗株数/接种单倍体胚数×100%。

2 结果与分析

2.1 单倍体胚成苗率

分别使用8种培养基配方，共培养单倍体胚488个，获得单倍体幼苗323株，成苗率66.19%，其中以1/2 MS为基础培养基培养单倍体胚255个，获得单倍体幼苗174株，成苗率68.24%，以B5为基础培养基培养单倍体胚233个，获得单倍体幼苗149株，成苗率63.95%。

2.2 基础培养基中不添加激素对小麦单倍体胚成苗率的影响

研究表明，对于春小麦单倍体胚而言，1/2 MS培养基和B5培养基中不添加激素均能够使单倍体胚萌发、生根分化成苗，两者的成苗率分别为73.49%和72.86%，差异不显著。相较于B5培养基，1/2 MS培养基上的单倍体胚生根更快，根系数量3～7条，长度为2～9 cm，幼苗发育较缓慢，但生长较为健壮，叶片较长(图1A)，而B5培养基上的单倍体胚萌发较快，但幼苗生长较弱，叶色较浅，根系生长缓慢，根系数量1～4条，长度为1～5 cm。虽然两种基础培养基上的成苗率并无显著差异，但是根据幼苗生长情况来看，1/2 MS培养基培养的幼苗生长健壮，根系发达，更适宜后期的移栽和加倍处理。表2，图1

表2 不同培养基胚培养效果
Table 2 Effect of embryos cultured in different mediums

培养基编号Medium No.单倍体胚数The number of embryos幼苗株数The number of plantlets根系数量The number of roots根系最大长度The maximum length of roots (cm)成苗率The percentage of plantlets formation (%)183615.26 7.99 73.49259436.14 8.41 72.88353354.69 7.53 66.04460353.03 6.15 58.33570512.75 4.88 72.86654344.50 6.42 62.96760333.97 6.24 55.00849312.68 4.95 63.27

注：A：春小麦单倍体胚在1号培养基上分化成苗；B：1、2号培养基幼苗生长状况对比(左：2号培养基，右：1号培养基)；C：7号培养基上幼苗生根情况；D：8号培养基上幼苗生根情况

Note: A: Plantlets production in No. 1 medium; B: Comparison of seedlings status in No. 1 and No. 2 mediums (left: No. 2 medium, right: No. 1 medium); C: roots of plantlets in No. 7 medium; D: roots of plantlets in No. 8 medium

图1 幼苗在不同培养基上生长
Fig.1 Conditions of plantlets in different mediums

2.3 基础培养基中添加激素对小麦单倍体胚成苗率的影响

研究表明，与基础培养基相比，添加激素使小麦单倍体胚成苗率呈现不同程度的下降，除了2号培养基(1/2 MS+0.1mg/L 2,4-D)下降不显著外，其余培养基成苗率下降均达到显著水平。2号培养基虽然成苗率较1/2 MS培养基下降了0.61%，但是幼苗叶色较深，叶片较宽，植株短粗，根系粗壮且数量较多，长度可达到10 cm以上(图1B)，单倍体胚基本可实现一步成苗，而且幼苗健壮，非常有利于后期的移栽和加倍处理。

添加激素的培养基中，单倍体胚培养3～5 d左右时呈现明显的膨大，但除2号培养基在5～7 d左右萌发出幼芽外，其余培养基均需10 d左右才会出现幼芽萌发，且萌发后生长迟缓，叶片细长，叶色也较浅，幼苗总体较弱。

试验设计的8个培养基中幼苗的生长情况表明，2,4-D对于小麦单倍体胚的生根具有明显的促进作用，在添加2,4-D的4种培养基中，根系发育较快，根系数量4～6条，根系最大长度均超过6 cm(图1C)，而在不添加2,4-D的3种培养基(除去1/2 MS培养基)中，根系数量仅为3条左右，根系最大长度为5 cm左右(图1D)。无论是在1/2 MS培养基还是B5培养基中，添加2,4-D对于小麦单倍体胚分化的促进作用较IAA更加明显，分别对比3、4、7、8号培养基，培养基中添加2,4-D单倍体胚成苗率、根系数量、最大根系长度均优于添加IAA的培养基。培养基中添加细胞分裂素6-BA对于小麦单倍体胚的分化并未起到促进作用，单倍体胚的成苗率、根系数量、最大根系长度均有不同程度的下降。表2，图1

3 讨 论

通过玉米花粉诱导春小麦产生单倍体胚，由于种间不亲和造成春小麦胚乳发育不全或不发育，因此，单倍体胚的分化更多依赖于外界提供的营养元素和激素，选择合适的培养基对于单倍体胚的分化具有重要的影响。研究采用了8种不同配方的培养基对春小麦单倍体胚进行离体培养，结果表明，相较于B5培养基，以1/2 MS为基础培养基更适宜新疆春小麦单倍体胚的分化，尤其是对于单倍体胚的根系分化促进作用明显，其中加入微量的2,4-D虽然在成苗率方面并无明显促进作用，但是对于单倍体胚的分化、生根、壮苗均能起到很好的促进作用，单倍体胚成苗率可达72.88%，且幼苗生长健壮，根系发达，这与赵翠荣[12]、陈新民[5]、陈淑萍[15]、蔡东明[14]、高艳[16]等的研究结果并不完全一致，究其原因，可能是由于春小麦基因型不同所致，也可能与单倍体胚发育状态有关。

细胞分裂素能够有效的促进细胞分裂并调控其分化，陈淑萍[15]、蔡东明等[14]通过1/2 MS培养基中添加6-BA能够显著提高小麦单倍体胚的成苗率，高艳等[16]在1/2 MS培养基中添加KT也明显提高了单倍体胚的成苗率，然而在试验中，添加6-BA并未提高春小麦单倍体胚的分化成苗率，反而造成了不同程度的降低，造成这一结果的原因可能与细胞分裂素的种类、使用浓度及其与生长素的使用比例密切相关，仍需对细胞分裂素促进春小麦单倍体胚分化作进一步研究。

陈淑萍[15]、高艳等[16]通过单倍体胚的离体培养均产生了丛生芽，试验中虽有部分培养基上的单倍体胚形成愈伤组织并产生了丛生芽，但大部分单倍体胚仍然只分化出了一株幼苗。通过单倍体胚分化丛生芽能够显著提高获得单倍体幼苗的数量，进而促进小麦×玉米远缘杂交技术在育种实践中的应用，还需对春小麦单倍体胚分化丛生芽的影响因素进行研究，在离体培养阶段提高单倍体植株的获得效率。

4 结 论

使用玉米花粉诱导春小麦产生单倍体胚，在1/2 MS培养基和B5培养基中均能够分化成苗，其中不添加激素的1/2 MS培养基成苗率最高，为73.49%。培养基中添加2,4-D能够有效促进春小麦单倍体胚的根系发育，其中1/2 MS +0.1 mg/L 2,4-D培养基上生长15 d的春小麦单倍体幼苗根系平均数量为6.14条，根系最大长度为8.41 cm，而且单倍体胚萌发快，幼苗健壮，叶色较深，根系生长迅速，一步成苗，可作为春小麦单倍体胚离体培养的适宜培养基。

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