参松养心对心肌梗死家兔心肌微循环的改善作用及机制研究

饶盼盼 党松 王晞

[摘要] 目的 探讨中成药参松养心对日本大耳兔心肌梗死模型心肌微循环的作用及其可能的机制。 方法 采用随机数字表法将30只6月龄SPF级日本大耳兔分为Sham组、Control组和MI+SSYX组，每组10只且雌雄各半。Control组和MI+SSYX组通过冠状动脉左前降支结扎建立心肌梗死模型，Sham组开胸后在冠状动脉下穿线，但不结扎。术后MI+SSYX组以参松养心0.4 g/（kg·d）溶液灌胃，Sham组和Control组以相同剂量的生理盐水灌胃。灌胃4周后，将各组日本大耳兔全部处死，在梗死心肌周边区取材，采用血管内皮标志物CD34免疫荧光染色法检测微血管密度，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中内皮素-1（ET-1）、血栓素A2（TXA2）、一氧化氮（NO）和血管性血友病因子（vWF）的水平。 结果 与Sham组比较，Control组与MI+SSYX组微血管密度明显降低（P < 0.05）；与Control组比较，MI+SSYX组微血管密度明显升高（P < 0.05）。与Sham组比较，Control组及MI+SSYX组内皮衍生因子ET-1、NO、TXA2、vWF血浆水平均显著升高（P < 0.05）；与Control组比较，MI+SSYX组ET-1、TXA2、vWF血浆水平均降低，NO血浆水平升高（P < 0.05）。 結论 参松养心可改善心肌梗死后家兔心肌微循环，其机制可能与参松养心能够促进心肌梗死周边区毛细血管生成，平衡内皮衍生的血管扩张因子和血管收缩因子的能力相关。

[关键词] 参松养心；心肌梗死；微循环；内皮衍生因子

[中图分类号] R259.414 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）12（a）-0010-04

中药参松养心是根据中医络病理论研制的复方制剂，主要由人参、麦冬、桑寄生、山萸肉、丹参、黄连、酸枣仁、五味子、赤芍、土鳖虫、甘松等组成，有益气养阴、活血通络、清心安神的功效[1]。该中药是临床上抗心律失常的常用药，有研究表明参松养心有抗急性心肌缺血损伤的作用[2]，我们的前期研究也表明参松养心对心肌梗死亚急性期的微循环有改善作用[3]。本研究进一步探究参松养心对心肌梗死家兔心肌微循环的影响并深入分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康6月龄SPF级日本大耳兔30只，体重2.2～2.7 kg（湖北省生物工程研究所，动物质量合格证号：4200-499472），在武汉大学实验动物室20～25℃恒温饲养。采用随机数字表法将其分为Sham组、Control组和MI+SSYX组，每组由10只且雌雄各半。术后MI+SSYX组以参松养心原粉（石家庄以岭药业股份有限公司，批号：S-131001）0.4 g/（kg·d）溶液灌胃，Sham组和Control组以相同剂量的生理盐水灌胃。

1.2 动物模型制备

采用冠状动脉左前降支结扎建立心肌梗死模型。动物称重后以0.8%戊巴比妥钠（40 mg/kg）耳缘静脉麻醉，固定体位，颈部和胸部备皮。连接实验用心电监护仪，观察心电图形态。酒精消毒，铺无菌洞巾。调节呼吸机参数，行常规气管插管。沿胸壁左旁正中开胸，用开胸器撑开切口，剪开心包，充分暴露心脏，寻找并结扎冠状动脉左前降支。以观察到结扎以下心肌颜色变暗，搏动幅度减弱，且心电监护显示Ⅰ、Ⅱ、aVL导联ST段抬高0.2 mV为手术成功的标准。Sham组开胸后在冠状动脉左前降支下穿线，但不结扎。关闭并逐层缝合切口。术后各组家兔均接受40万U青霉素（华北制药股份有限公司，批号：1204103）肌内注射，连续3 d，预防感染。

1.3 免疫荧光检测

治疗4周后，将三组家兔全部处死，取梗死心肌周边组织，用4℃生理盐水清洗残留血液后浸泡在4%多聚甲醛中固定24 h。经梯度酒精脱水和石蜡包埋后，将石蜡切片浸入二甲苯脱蜡，梯度酒精中逐渐水化后行抗原修复，然后按照试剂盒（Abcam，批号：ab81289）说明书进行CD34及DAPI免疫荧光双标。每张切片在光学显微镜下放大400倍，随机选择5个视野进行CD34染色阳性计数（凡是染成棕黄色的血管内皮细胞或者内皮细胞簇均作为1个血管计数，管腔直径超过2 μm或肌肉层超过3层的血管均不计数），并取5个区域的CD34阳性计数的平均数作为该切片的微血管密度。

1.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

治疗4周后，三组家兔均通过采血针从颈静脉抽取2 mL血注入真空分离胶促凝管中，静置10 min后置于离心机中以转速3000 r/min、离心半径8 cm离心15 min，收集上清液并放在-80℃冰箱保存备用。然后按照试剂盒（HCB，Canada）说明书进行ELISA试验，检测血浆样本中内皮素1（ET-1）、一氧化氮（NO）、血栓素A2（TXA2）和血管性血友病因子（vWF）水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌梗死模型

心肌梗死模型制备过程中，2只新西兰大耳白兔意外死亡（1只死于心律失常，1只原因不明），剩余28只（Sham组10只、Control组9只、MI+SSYX组9只）均制备心梗模型成功，且顺利完成各指标的检测。模型制备成功的心电图见图1。

2.2 三组家兔心肌梗死周边区心肌微血管密度比较

与Sham组比较，Control组及MI+SSYX组微血管密度明显降低（P < 0.05）。与Control组比较，MI+SSYX组微血管密度明显升高（P < 0.05）。见图2（封三）。

2.3 三组家兔ET-1、NO、TXA2和vWF血浆水平的比较

与Sham组比较，Control组及MI+SSYX组ET-1、NO、TXA2、vWF血浆水平均显著升高（P < 0.05）。与Control组比较，MI+SSYX组ET-1、TXA2和vWF血浆水平均降低（P < 0.05），NO血浆水平升高（P < 0.05）。见图3。

3 讨论

本研究探究参松养心对心肌梗死的日本大耳兔心肌微循环的作用及其可能的机制。结果显示，参松养心可以增加梗死心肌周边区域的微血管密度，降低血浆中内皮衍生子TXA2、ET-1、vWF水平，升高NO水平，即平衡内皮衍生的血管扩张因子和血管收缩因子，从而改善心肌梗死后梗死周边组织心肌微循环。

中医认为急性心肌梗死为本虚标实之证，本虚包括气、血、阴、阳不足，以气虚、阳虚为主，标实包括寒凝、气滞、血瘀、痰浊，以血瘀、痰浊为主[4]。参松养心是基于中医络病学理论研制而成的具有益气养阴、活血通络功效的中成药。方中人参有大补元气、复脉固脱、生津安神等功效[5]。对于心血管系统，研究显示人参能够保护血管内皮细胞、抗心律失常、降压、抑制心室重构、改善高脂血症、抗心源性休克等[6]。麦冬为常用的养阴中药，药理实验表明麦冬有很好的抗血栓作用，能增加心肌收縮力和冠脉流量，保护血管内皮细胞[7]。丹参为临床上常用的活血化瘀药物，有抗氧化、抗血小板聚集、保护血管内皮、改善微循环等药理作用[8-9]。桑寄生有补肝肾、益精血、祛风湿、通经络、养血脉、安胎元的作用。且有临床研究表明，桑寄生对心律失常、心痛、短气均有疗效[10-11]。山茱萸能改善血管内皮损伤，且与调节血管活性物质ET/NO、TXA2/PGI2稳态有关[12]。根据热毒伤络的假说，黄连作为清热解毒的代表药，对梗死心肌血液循环也有改善作用[13-14]。酸枣仁能镇静催眠、保护心肌细胞、抗动脉粥样硬化、降血压、降血脂、改善血液流变学以及加强学习记忆能力等[15]。土鳖虫是传统的活血化瘀药，中医临床上用于治疗冠心病、高血压，具有抗凝血、抗缺氧、调血脂、抗突变、保护血管内皮细胞等作用[16]。甘松具有镇静降压，抗心律失常、溃疡、细胞毒活性、疟疾的作用[17]。从药方各组分药理作用来看，参松养心为改善心肌梗死血液循环的对症药。

有研究表明，微血管功能障碍是决定急性心肌梗死（AMI）患者3个月后左室射血分数（LVEF）和左室重塑程度的重要因素[18]。冠脉闭塞导致细胞坏死，引起毛细血管等微血管损伤及心肌再灌注损伤，最终引起水肿和微血管内皮功能障碍，导致大约40%的AMI患者成功再灌注治疗后出现心肌“无复流”现象（no-reflow phenomenon）[19-20]。因此，改善AMI患者的微血管功能是必要的治疗措施。但目前AMI管理主要强调及时开放心脏表面的梗阻冠脉，治疗主要集中在及时开通大血管上，重建走行于心肌内的微血管血供并未得到临床治疗重视。血管内皮细胞调节冠状动脉血流量主要通过释放血管活性因子，其中NO是一种主要的内皮细胞衍生的扩血管因子[21-22]，ET-1是一种内源性的血管活性肽，对冠状动脉发挥稳定而持久的血管收缩作用，是最有效的血管收缩剂之一[23]。TXA2具有很强的促血小板聚集作用，是增加心肌梗死患者发病率和死亡率重要的风险因子之一[24-25]。生理状态下，内皮细胞合成vWF，调节内皮细胞黏附于血管壁；病理状态下，活化的血小板释放vWF介导血管损伤部位的血小板聚集和黏附于胶原，促进血栓形成[26-27]。参松养心能有效调节这两类内皮衍生因子，改善心脏微循环。

综上所述，参松养心药方的配伍原理及各成分的药理作用与本研究的实验结果相互支持，可以认为参松养心能够通过重建和维持AMI后心肌微血管灌注，起到保护心肌的作用。但有待进一步研究以明确作用机制，如所涉及微循环保护的具体信号通路等。

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（收稿日期：2018-06-11 本文编辑：罗乔荔）