微小RNA—200a对肺癌细胞增殖影响及抑癌基因功能分析

谢悦　　董礼文　　王军　　李雄伟

[摘要] 目的 分析miRNA-200a對肺癌细胞增殖影响及抑癌基因功能影响。 方法 Real-time PCR对正常肺支气管上皮细胞16HBE、肺癌细胞SK-MES-1、NCI-H520、A549及25例非小细胞癌癌旁组织与癌组织内miR-200a表达量检测，CCK-8法检测肺癌A549细胞增殖活性受miRNA-200a影响状况，生物信息学对miRNA-200a靶基因进行预测，双荧光素酶联合Western blot及Real-time PCR检验YAP1受miRNA-200a调控影响。CCK-8法检测肺癌549细胞受YAP1增殖影响。 结果 肺癌细胞株SK-MES-1、NCI-H520及A549内miR-200a表达量均低于正常细胞株16HBE，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-200a mimics组内A549细胞在48、72及96 h时其吸光度均低于Mimics-NC，差异有统计学意义（P<0.05）。肺癌A549转染siRNA-NC或者siRNA-YAP1后，PCR检测显示siRNA-YAP1内YAP1 mRNA表达量为（0.37±0.06），siRNA-NC内YAP1 mRNA表达量为（1.03±0.07），差异有统计学意义（P<0.05）；Western blot显示siRNA-YAP1内YAP1蛋白表达量比siRNA-NC低；siRNA-YAP1内YAP1细胞吸光度在48、72及96 h时均低于siRNA-NC，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 miR-200a对肺癌细胞增殖的抑制作用主要是经过靶向作用YAP1基因来实现的，进而在肺癌内起到抑癌功能。

[关键词] 肺癌；miRNA-200a；YAP1；细胞增殖

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）31-0020-05

Analysis on the effect of microRNA-200a on proliferation of lung cancer cells and function of tumor suppressor gene

XIE Yue DONG Liwen WANG Jun LI Xiongwei

Department of Cardiothoracic Surgery，Hangzhou Hospital of TCM，Affiliated Guangxing Hospital of Zhejiang Chinese Medicine University， Hangzhou 310000，China

[Abstract] Objective To analyze the effects of miRNA-200a on the proliferation of lung cancer cells and the function of tumor suppressor genes. Methods Real-time PCR was used to detect the expression quantity of miR-200a in normal lung bronchial epithelial cells 16HBE， lung cancer cells SK-MES-1， NCI-H520， A549 and non-small cell carcinoma para-carcinoma tissue tissues and cancer tissues in 25 cases. CCK-8 assay was used to detect the effect of miRNA-200a on the proliferation activity of lung cancer A549 cells. Bioinformatics was used to predict miRNA-200a target genes， and dual fluorescein combined with Western blot and Real-time PCR were used to detect the effect of miRNA-200a regulation on YAP1. CCK-8 assay was used to detect the effect of YAP1 proliferation on lung cancer 549 cells. Results The expression quantity of miR-200a in lung cancer cell lines SK-MES-1， NCI-H520 and A549 was lower than that in normal cell line 16HBE， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The absorbance of A549 cells in miR-200a mimics group was lower than that of Mimics-NC at 48， 72 and 96 h， and the difference was statistically significant（P<0.05）. After lung cancer A549 was transfected with siRNA-NC or siRNA-YAP1， PCR detection showed that the expression quantity of YAP1 mRNA in siRNA-YAP1 was（0.37±0.06）， and the expression quantity of YAP1 mRNA in siRNA-NC was（1.03±0.07）. The difference was statistically significant（P<0.05）； Western blot showed that the expression quantity of YAP1 protein in siRNA-YAP1 was lower than that of siRNA-NC； the absorbance of YAP1 cells in siRNA-YAP1 was lower than that of siRNA-NC at 48， 72 and 96 h， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The inhibitory effect of miR-200a on the proliferation of lung cancer cells is mainly achieved by targeting the YAP1 gene， which in turn plays a tumor suppressor function in lung cancer.

[Key words] Lung cancer； miRNA-200a； YAP1； Cell proliferation

肺癌为临床常见肿瘤，特别是近些年来，随着人们生活环境和生活方式的改变，肺癌发病率逐渐升高，对人们的生命安全产生了严重影响。伴随生物技术不断深入探究，肿瘤疗法的一个新的研究热点为驱动基因分子靶向疗法，为临床患者提供了新的治疗手段。微小RNA（miRNAs）为长度17～25个核苷酸高度保守、内源性单链非编码RNA，能够结合下游3-非编码区（3-UTR），可使mRNA降解或在转录后对其翻译起抑制作用，在机体肿瘤进展中有“抑癌基因”或“癌基因”影响[1-2]。miR-200家族一员miR-200a定位在机体好的染色体内，相关研究显示，机体恶性肿瘤进展和miR-200a的异常表达有一定联系，在多数肿瘤内如肝癌、胰腺癌、肾细胞癌等miR-200a表达量降低，有“抑癌基因”影响，同时有研究显示，在卵巢癌及鼻咽癌等肿瘤内其表达升高，有“癌基因”影响[3-4]。因此，本研究通过分析miRNA-200a对肺癌细胞增殖影响及抑癌基因功能影响，为临床患者治疗提供一些实验室依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

组织标本：选取2017年3月～2018年1月间在本院进行手术的非小细胞肺癌患者25例，收集其肺癌组织及癌旁组织（离肿瘤边缘5 cm以上），置于液氮并保存于-80℃冰箱内，肺癌患者均经过病理切片确诊，其中男17例，女8例，年龄40～65岁，平均（55.37±6.81）岁，依据WHO肺癌分类，腺鳞癌2例、鳞癌9例，腺癌14例。本文研究经医院伦理委员会批准，患者或家属知情并签署同意书。

试剂和细胞：β-cation及YPA1抗体（由美国Abcam公司生产），正常肺支气管上皮细胞株16HBE、肺鳞癌细胞系SK-MES-1、NCI-H520及非腺癌细胞系A549（由美国ATCC公司生产），CCK-8试剂盒（由上海东仁化学公司生产），LipofectamineTM2000、Trizol试剂（由美国Invitrogen公司生产），YAP1 siRNA质粒、阴性对照mimics-NC、miR-200a mimics、siRNA-NC（由美国Santa Cruz公司生产），YAP1、miR-200a和内参GAPDH、U6引物均为上海吉玛公司合成，pmirGLO载体、RNA逆转录试剂盒、双荧光素酶试剂盒及Real-time PCR试剂盒（由美国Promega公司生产）。

1.2 研究方法

1.2.1 培养细胞与转染 16HBE、SK-MES-1、NCI-H520和人肺癌细胞株A549均放置在RPMI 1640培养基（包含10%胎牛血清）内，含5% CO2、37℃培养箱内进行培养，2～3 d按照1：3进行传代。细胞培养板内选取A549对数生长期肺癌细胞进行接种，细胞贴壁在70%～80%行转染，依据LipofectamineTM2000试剂盒的说明来行相关操作，对siRNA-NA、miRNA-200a mimics、siRNA-YAP1及mimice-NC转染。

1.2.2 Real-time PCR对YAP1 mRNA、miR-200a进行检测 Trizol试剂对细胞或者组织总RNA进行提取，并检测RNA含量，选取总RNA 1 mg依据逆转录试剂盒的说明反转录获取cDNA。Real-PCR体系，反应条件：95℃下3 min、95℃下10 s、59℃下30 s，共进行40循环。内参为U6/GAPDH，2-△△Ct计算YAP1、miR-200a mRNA表达量。

1.2.3 Western blot对YAP1蛋白表达量检测 转染48 h后采集细胞，PBS洗涤3次，细胞总蛋白使用蛋白裂解液提取，蛋白含量使用BCA法检测。选取蛋白40 mg上样，在SDS-PAGE电泳30 min，而后将蛋白质转移到PVDF膜内，5%脱脂奶粉封闭液加入，在室温下封闭2 h，β-actio、YAPA1一抗加入，在0℃下过夜，第2天洗膜，二抗加入后在室温下孵育2 h，洗膜ECL发光剂加入，凝胶成像显影，YPA1和β-actin的蛋白条带灰度比值为YPA1表达量。

1.2.4 CCK-8对细胞增殖活力检测 96孔板内接种转染24 h后细胞，行常规培养，依据CCK-8试剂盒说明在转染24、48、72及96 h时加入CCK-8溶液10 mL，在剂量为50 mL/L的CO2、37℃培养箱内孵育2 h，450 nm吸光度使用酶标仪检测，重复3次。

1.2.5 预测miR-200a靶基因和双荧光素酶验证 使用miRNA靶基因的预测软件miRanda联合基因功能分析，筛出miR-200a直接靶基因可能为YAP1。带有突变型联合位点荧光载体pmirGLO-YAP1-mtUTR与带野生型联合位点荧光载体pmirGLO-YAP1-wtUTR由上海吉玛公司构建。行转染前1 d，24板孔内接种肺癌A549细胞，在转染当前把测序验证正确pmirGLO-YAP1-mtUTR或者pmirGLO-YAP1-wtUTR荧光载体和mimics-NC或者miR-200a mimics对肺癌A549进行转染，并分成四组，在转染48 h后采集细胞，依据双荧光素酶活性说明书对海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶活性检测。荧光酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

使用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料且符合正态分布以（x±s）表示，采用t检验或方差分析，P<0.05为差异有统计学意義。

2 结果

2.1非小细胞肺癌细胞及组织内miR-200a表达状况

肺癌细胞株SK-MES-1、NCI-H520及A549内miR-200a表达量均低于正常细胞株16HBE，差异有统计学意义（P<0.05）（表1），且A549内表达量最低，所以在后续研究中选取A549。

2.2 miR-200a表达上调对肺癌细胞A549增殖活力抑制状况

PCR检测显示A549转染以后miR-200a mimics细胞内miR-200a的表达量为（5.61±0.42），转染Mimic-NC组细胞内miR-200a表达量为（1.05±0.40），差异有统计学意义（t=4.072，P<0.05），说明转染效果比较高。CCk-8检测显示miR-200a mimics组内A549细胞在48、72及96 h时其吸光度均低于Mimics-NC，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 miR-200a直接调控靶基因为YAP1

采用miRanda靶基因预测数据库联合基因功能显示，YAP1可能为miR-200a靶基因，miR-200a种子序列和YAP1 3-UTR在理论上有互补结合位点。miR-200a mimics结合野生型YAP1-wtUTR后其细胞荧光素酶活性比低于miR-200a mimics结合野生型YAP1-wtUTR，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 miR-200a上调后对YAP1蛋白及mRNA表达抑制影响

PCR检测显示，miR-200a内YAP1 mRNA表达量为（0.54±0.07），Mimics-N内YAP1 mRNA表达量为（1.07±0.09），差异有统计学意义（t=4.071，P<0.05），Western blot显示miR-200a内YAP1蛋白表达量比Mimics-NC低。见图1。

2.5 YAP1下调对肺癌A549增殖活力抑制状况

肺癌A549转染siRNA-NC或siRNA-YAP1后，PCR检测显示siRNA-YAP1内YAP1 mRNA表达量为（0.37±0.06），siRNA-NC内YAP1 mRNA表达量为（1.03±0.07），差异有统计学意义（t=4.180，P<0.05）；Western blot显示siRNA-YAP1内YAP1蛋白表达量比siRNA-NC低（图2）；CCk-8检测显示siRNA-YAP1内YAP1细胞吸光度在48、72及96 h时均低于siRNA-NC，差异有统计学意义（P<0.05）（表4）。

3 讨论

miR-200a是miR-200成员之一，当前相关研究显示机体恶性肿瘤和miR-200a异常表达联系紧密[5]，Gao SL等[6]研究显示，神经母细胞瘤内miR-200a表达量比癌旁组织显著下降，而miR-200a表达上调后可经过靶向AP-2γ基因对成瘤及肿瘤细胞增殖有抑制作用。Yao J等[7]研究表明乳腺癌患者机体内miR-200a表达量降低，而miR-200a表达上调后可经过靶向TFAM基因对肿瘤细胞增殖起到抑制作用。本研究经过Real-time PCR对正常肺支气管上皮细胞16HBE、肺癌细胞SK-MES-1、NCI-H520、A549及25例非小细胞癌癌旁组织与癌组织内miR-200a表达量检测显示，肺癌细胞系及非小细胞肺癌组织内miR-200a表达量均显著下降，和其他相关研究一致。为进一步分析miR-200a对于肺癌细胞的增殖状况，本研究经过脂质体介导把miR-200a mimics转染到肺癌A549细胞内，A549细胞成功过表达miR-200a。CCK-8检测显示，miR-200a过量表达对肺癌A549细胞增殖活力有抑制作用，说明miR-200a对肺癌细胞增殖有抑制影响，为肺癌的“抑癌基因”。

一个miRNA能够参加到多个靶基因的调控，同时每个靶基因会受到数个miRNA进行同时调控。在肿瘤内miRNA影响取决于调控下游靶基因内生物学效应[8-10]。Chen Y等[11]研究显示，miR-200a能够经过靶向TSOAN1对肺癌细胞侵袭起到抑制作用。Zhen Q等[12]研究表明miR-200a可经过靶向c-Met及EGFR对肺癌细胞转移和侵袭起到抑制影响。为分析miR-200a对于肺癌细胞增殖相关机制，本研究采用靶基因的预测数据库，同时联合基因功能进行判别，结果显示YAP1可能为miR-200a靶基因，miR-200a种子序列和YAP1 3UTR区在理论上其结合位点可互补，经过双荧光素酶验证miR-200a可和YAP1 3UTR区特异性联合，降低荧光蛋白表达量，为更进一步证明miR-200a靶基因是否是YAP1，使用Western blot与Real time PCR检测显示miR-200a表达上调后可使YAP1蛋白及mRNA表达量下降，说明miR-200a对于YAP1基因有负调控影响，也验证了miR-200a直接靶基因为YAP1。YAP1为Hippo信号路径下游的信号分子，对于机体内源性稳态、DNA修复及细胞生长发育有重要影响[13-15]。相关研究显示，YAP1在正常活化状况时加速机体修复创伤，而在超激活状况时对细胞增殖有加速作用，促进产生肿瘤[16-18]。本研究经过YAP1表达量下调对肺癌A549细胞增殖有抑制作用，与miR-200a表达上调对肺癌A549细胞影响一致，由此说明miR-200a可经过调控YAP1基因而对肺癌细胞增殖发挥作用，与王新胜[19]关于 MicroRNA-200a靶向调控对肾细胞癌生物学行为影响相近，值得给予关注。有报道研究显示很多肺癌组织内都有S期激酶相关蛋白2，而且随着肿瘤恶性程度的增加体内S期激酶相关蛋白2表达也显著加强，S期激酶的相关蛋白2则和磷酸化细胞周期的负性调控因子p27表達为负相关[20]，S期激酶相关蛋白2能够特异性辨别抑癌的基因p27，经过泛素化路径使p27降解，细胞周期出现异常调控，参加了肺癌细胞的增殖与发展。

综上所述，miR-200a对肺癌细胞增殖的抑制作用主要是经过靶向作用YAP1基因来实现的，进而在肺癌内起到抑癌功能。

[参考文献]

[1] 蒋庚西，李春光，赵铁军，等. 沉默Yes相关蛋白1对人非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭的影响[J]. 第二军医大学学报，2017，38（8）：1004-1008.

[2] 周立江，潘玉真，殷东风. 肺积宁方影响Lewis肺癌细胞增殖和自噬的作用机制研究[J]. 中华中医药学刊，2016，9（7）：1739-1742.

[3] 王江，王旭东，赵凤仪，等. YAP1在人肺腺癌细胞厄洛替尼耐药中的作用[J]. 军事医学，2016，40（1）：35-39.

[4] 王巍炜，王德光，巫正伟，等. 纳米雄黄对肺癌A549細胞增殖、凋亡及迁移的影响[J]. 中国组织工程研究，2016，20（34）：5098-5103.

[5] 尹媛，许伟，吴双双，等. miRNA-200a调控FOXC1增敏肺癌EGFR-TKI治疗的研究[J]. 南京医科大学学报：自然科学版，2017，13（9）：1067-1075.

[6] Gao SL，Wang LZ，Liu HY，et al. miR-200a inhibits tumor proliferation by targeting AP-2γ in neuroblastoma cells[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention Apjcp，2014，15（11）：4671-4674.

[7] Yao J，Zhou E，Wang Y，et al. microRNA-200a inhibits cell proliferation by targeting mitochondrial transcription factor a in breast cancer[J]. Dna Cell Biology，2014，33（5）：291-300.

[8] 肖荣，康马飞，骆梅青，等. 重组人白细胞介素-11对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响[J]. 天津医药，2016，44（1）：46-49.

[9] 张菊，关恒云，张鹏举，等. miRNA let-7a1真核表达载体的构建及对肺癌细胞增殖的影响[J]. 中国病理生理杂志，2009，25（8）：1495-1500.

[10] 张丽，袁伟燕，石红琴，等. Prdx4蛋白表达水平的改变对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡和迁移的影响[J]. 肿瘤，2017，37（4）：340-349.

[11] Chen Y，Peng W，Lu Y， et al. MiR-200a enhances the migrations of A549 and SK-MES-1 cells by regulating the expression of TSPAN1[J]. Journal of Biosciences，2013， 38（3）：523-532.

[12] Zhen Q，Liu J，Gao L，et al. MicroRNA-200a targets EGFR and c-Met to inhibit migration，invasion，and gefitinib resistance in non-small cell lung cancer[J]. Cytogenetic & Genome Research，2015，146（1）：1-8.

[13] 郑礼平，张楠，梁翠微，等. miR-221通过下调PTEN促进肺癌A549细胞增殖[J]. 中国病理生理杂志， 2017， 33（12）：219-223.

[14] 刘宇，谭金晶，李琳，等. dlk1促进肺鳞癌细胞增殖的相关分子机理研究[J]. 中国肺癌杂志，2010，13（10）：923-927.

[15] 梁宗英，张乐，侯继申，等. 大蒜素对肺癌细胞增殖与凋亡的影响[J]. 山东医药，2017，57（6）：27-29.

[16] 徐驰，汪栋，苏长青，等. 上调miRNA-145对肺癌细胞系A549增殖和凋亡的影响[J]. 中国肿瘤临床与康复，2016，13（7）：769-772.

[17] 姚佳，周恩相，徐峰，等. MicroRNA-200a/TFAM通路调控紫杉醇对乳腺癌细胞的化疗敏感性[J]. 肿瘤药学，2017，7（5）：528-533.

[18] 许璐，方玉松，王丹云，等. miR-200a抑制YAP1基因表达对肺癌细胞增殖的影响[J]. 中国肿瘤临床， 2017， 44（7）：311-315.

[19] 王新胜. MicroRNA-200a-3p靶向调控SPAG9基因对肾细胞癌生物学行为的影响[D]. 吉林大学，2016.

[20] 李铁鹏，张放，韩露，等. 肺癌干细胞的分离、鉴定及特异性表达microRNA的筛选[C].全国肿瘤生物治疗大会，2015.

（收稿日期：2018-07-12）