直接扩增技术在法医DNA检验中的研究进展

沈 伟，马 骏，潘豪杰，邓明明，李 翘，任文彦

(1. 浙江千麦司法鉴定中心，杭州 311121；2. 浙江省长兴县公安司法鉴定中心，浙江长兴 313100；3. 浙江省公安物证鉴定中心，杭州 310009）

以STR为标记的法医DNA分型技术, 以其自动化程度高、快速、灵敏、准确、稳定、重复性好等优特点[1]，而成为当前公安机关案件侦破及鉴定科学证据系统中的科技利器。目前法医DNA分型技术涉及到DNA提取与定量、PCR扩增及电泳检测等多个操作步骤，故对于某些急、难案件, 检验速度不能满足需要。近年来，随着生物物证DNA检验技术和商业化复合扩增试剂盒的发展，直接扩增技术（简称直扩技术）由于具有缩短检验时间[2-3]、提高灵敏度、减少操作步骤和降低污染风险[4]等优点，得到了国内外法医从业者的广泛关注和研究运用[5-7]，现本文对此作综述。

1 直扩技术及特点

直扩技术又称直接PCR或免提取扩增技术，是将样本不经DNA提取或其它前处理步骤而直接加入PCR反应体系并获得扩增产物的操作[8]，故其对目标载体的选择或更有针对性，能在保证获得足够模板DNA的同时，更易得到单一个体来源的DNA分型。与传统方法相比，直扩技术具有如下优点：首先省略了DNA提取及DNA定量步骤，仅通过扩增和检测两个步骤即可获得完整的STR分型，大大缩短了DNA检验的时间；其次在检验过程中不需更换反应管，这样就避免了常规检验过程中转移样品或试剂可能造成的污染；另外，节约了提取试剂和相关耗材。该技术快速、准确、高效，能极大地提高我国当前DNA数据库建设水平、增强我国公安机关应对一些大规模灾难性事故、群体性突发事件DNA样本检验的处理能力[9]。尽管目前提取DNA的方法和试剂仍在不断改进，但是各种方法在提取过程中的转移和洗涤等步骤都会导致不同程度的DNA损失[10-12]，且还可能引入外源性的DNA污染[13]。直扩技术通过直接把DNA载体放入PCR管中扩增，可避免提取过程中DNA的损失，又能减少污染风险。Swaran[14]对玻璃、塑料、陶瓷和不锈钢四种载体上的DNA进行直扩和提取的比较，发现四种载体上的DNA经过直扩后得到的荧光信号均高于其对应提取物，并且等位基因缺失的概率更小。当前直扩技术已在衣物[4]、血迹[14]、全血[15]、唾液[16]、毛囊[17]、指纹[18]、指甲[19]等检材中得到了成功的应用。

2 商业化STR扩增试剂盒所用的直扩技术

2.1 商业化直扩试剂盒的应用

目前已有的直扩STR试剂盒，如Identi filer Direct、PowerPlex 16 HS、Typer15 Plus、PowerPlex 18D和GlobalFiler Express等，都能够在有血红素和其他PCR 抑制剂存在的情况下实现PCR扩增，因此可以不对生物样本进行提取纯化而直接扩增[8]。这些直扩试剂盒所针对的生物样本大都是基于FTA卡提取的血细胞和口腔上皮细胞，主要用于DNA数据库建设。国内外很多学者对此类商业试剂盒的直扩效果做了验证和比较[20-22]。Myers[23]对IdentiFiler Direct、IdentiFiler Plus 、PowerPlex 18D三种试剂盒经由FTA卡进行了直扩比较，发现IdentiFiler Direct和PowerPlex 18D的成功率约为96%，IdentiFiler Plus的为94%，但是有15%的分型会在某些基因座出现加A不完全现象。商业化直扩试剂盒促使直扩技术在国内外数据库建设中应用趋于广泛[24-26]。

2.2 商业化非直扩试剂盒中直扩技术的应用

目前大部分商业化试剂盒中的PCR Buffer增加了增强剂和抗抑制剂，可以抵抗检材基质上的抑制效应，提高低浓度样品的成功率，从而使非直扩的商业化试剂盒进行直扩也有不错的效果。刘亚举[27]使用Identi filer Plus试剂盒对常见的案件生物检材进行直扩，结果显示用Identi filer Plus试剂盒直扩方法简单、快速稳定、检材量小，缩短了DNA检验时间，可在实际检案中选用。钱水[6]对330份案件检材进行了PowerPlex 21试剂盒的直扩，结果显示污染轻的新鲜检材均能获得良好效果，污染重或腐败降解检材直扩效果不理想。330份检材同步用磁珠法提取后再用PowerPlex 21试剂盒扩增检验，两者检材检出成功率差别不明显。Brito[28]使用GlobalFiler试剂盒对一起强奸案和一起凶杀案中的检材进行直扩，强奸案的检材检出了受害者和嫌疑人混合的DNA分型，凶杀案则在嫌疑人的衣服上检出了受害人的DNA分型。

3 常见生物检材的直扩

PCR起始步骤的95℃热启动也可以裂解细胞而释放出DNA[4]，所以免提取直接扩增受到众多学者的研究和探索。但对于有限量或微量检材，是否采用直扩还是先行DNA提取需慎重，否则直扩后，就无法再进行其他系统检验了。

3.1 毛发直扩

Ottens[17]对30根毛发的毛囊以NGM试剂盒进行直接扩增，均获得了成功分型，其中还包括保存了5年的毛发。他还对毛发的直扩做了优化，指出直接扩增省去了提取步骤，但因无法进行DNA定量，有些毛发直扩会因模板太浓导致双肩峰或pull-up峰，而减少扩增循环数又有加大等位基因丢失的风险。稀释PCR产物应是一个很有效的方法，既可以减少PCR的伪峰，又不会增加等位基因丢失的可能性[29]。高波[30]比较了Power Plex21直接扩增法与磁珠提取扩增法用于带毛囊毛发STR检验的效果，发现自然脱落带毛囊的毛发直扩检出STR基因型的成功率为55%，磁珠提取后扩增检出STR基因型的成功率仅为25%，故直扩法比磁珠提取后扩增更适于带毛囊毛发的STR检验。

3.2 血液或唾液直扩

血液和唾液的直扩技术已较成熟，相关文献也很多，已经证实对此类检材直扩方法简单、快速、稳定、检材用量小，可在实际检案中选择使用[6,14,16,22]。Dargay[31]对烟头、秸秆、草、树叶、木片和七种不同类型织物上的血液和唾液进行了Y filer Direct、Y filer Plus和PowerPlex Y23三种试剂盒的直扩，大部分分型都获得了成功。钱水[6]指出对于烟蒂取其海绵部分直接扩增效果明显优于烟纸，实验中20枚现场提取的烟头，以PowerPlex21试剂盒直扩，15枚直接扩增及磁珠提取后扩增均成功分型，2枚泡过水后晾干的烟头，剪取海绵直接扩增只检出性别及3～5个小片段基因座，而用磁珠提取后能成功检出全部基因型。李林[32]使用Identi filer Direct PCR试剂盒直扩，20份烟蒂中有2份未得到分型图谱，分析原因可能是剪取的检材脱落细胞含量少，故经再次取材而检验成功。因此针对烟蒂唾液斑类检材，在使用直接扩增法时应尽量选取嘴唇接触或唾液斑痕明显之处进行剪取，也可多剪取几处分别扩增而相互佐证，以保证得到正确的分型结果。

3.3 肋软骨直扩

李林[32]使用Identi filer Direct PCR试剂盒对较为新鲜的肋软骨直扩，成功率100%。钱水[6]和王传海[33]均采用PowerPlex21试剂盒对肋软骨进行了直扩，成功率分别为75%和95.45%。钱水还发现，对于较脏、污染重的检材，直接扩增往往分型失败，而磁珠提取后扩增可成功检出全部基因型[6]。王传海则认为，磁珠法和直扩法成功率完全一致，直扩法检验未得到STR分型的检材，采用磁珠法提取DNA后扩增检验也未得到STR分型，另外取材应尽量选取中间部位以提高直扩成功率[33]。

3.4 衣物上的DNA直扩

Linacre[4]等通过以2男1女为志愿者对各种类型的布料进行接触模拟实验，证实直扩法比提取法能得到更多的等位基因和更高的峰值。杨电[34]通过比较擦拭直扩法和粘取磁珠法检测衣物脱落细胞DNA，使用PowerPlex21试剂盒扩增，发现两种方法获得的衣物接触DNA的STR图谱在成功率、峰型、峰高和均衡性方面都无明显差别，但直扩法可使实验步骤简化、缩短检验时间、降低检验成本，同时还可节约检材、方便复检。李长征等[35]直接剪取10件上衣和10只手套上可能含有脱落细胞的部位，采用Identi filer Direct PCR试剂盒扩增，结果显示直接扩增法成功率明显高于常规Chelex提取后扩增的方法，有7件上衣和9只手套通过直扩获得了全部基因型。

4 接触DNA类生物检材的直扩

4.1 接触类细胞DNA的直扩

一个人大约每天要脱落40万个上皮细胞，这构成了接触DNA的主要来源[36]。在采集接触性细胞DNA时，棉签类型、擦拭试剂和处理方法都会对DNA检验产生影响。对于接触性细胞DNA的转移，目前大多数实验室采用的是无菌棉签蘸去离子水擦拭载体。 Templeton[7]通过直扩对三种不同类型的拭子在采集和释放DNA方面的效果做了比较，发现意大利COPAN公司生产的植绒拭子效果最好；另外他还用植绒拭子蘸取 Triton X-100对34个正常人的170个指纹进行擦拭后做直扩，有71%指纹得到有效分型。利用这种方法，他们帮助南澳大利亚警察从毒品包装的胶带指痕上通过直扩得到了31个主要等位基因和10个次要等位基因的混合分型[18]。Thomasma[37]使用棉签蘸取六种不同的试剂后擦拭指纹进行比较分析，发现蘸水擦拭得到的DNA量最低，而用SDS和 Triton X-100能够显著增加DNA的量，概因这些试剂具有比水更容易溶解膜蛋白和脂类的能力，故能够获得更多的DNA。Triton X不但有助于细胞裂解，并且由于其高黏度，还可防止DNA粘附在PCR反应管壁上而对扩增效率产生影响[38]。

4.2 接触性游离DNA的直扩

近年来，游离DNA也逐渐引起了国内外法医工作者的关注和研究。游离DNA (cell-free DNA，cfDNA)，又称为细胞外DNA，已经发现分布于人血浆和尿液等其他体液中[39]。目前，cfDNA被临床广泛研究而成为多种疾病无创诊疗监测及预后评估的重要分子标志物，但在法医学的研究与应用罕有报道。cfDNA主要来源于凋亡和坏死细胞，与细胞核DNA序列一致，提取后可增加基因组DNA的量从而能完善DNA分型，在法医学中应有较大的潜在应用价值。游离DNA也是接触DNA的来源之一[40]。

Kita等[41]研究认为在人体皮肤表面存在少量的游离DNA，能通过触摸转移到客体表面。Quinones[42]研究发现在80%的健康人汗液中存在有游离DNA，平均每毫升汗液中存在约11.5ng的游离DNA，所以要想提高接触类DNA的检验成功率，就必须把游离DNA与细胞核DNA一样用于DNA分型检测中。Vandewoestyne[43]通过对包括血液、唾液、衣服和呕吐物等检材做研究，均发现了游离DNA的存在。他指出在对接触类、斑痕类检材分型时，作为重要组成部分的cfDNA却往往被丢弃，如采用Chelex-100法提取DNA过程中含有cfDNA的检材浸液在离心后被弃掉，这就意味着一些潜在的DNA样品及其信息被同时丢弃了。郝晓明[44]等对人体尿液、唾液、血液3种生物检材中的游离DNA进行磁珠直接吸附法提取检验，在3种检材中均检出了游离DNA，总分型成功率达72%。董会[45]的研究表明在常规微量接触类检材和口腔拭子中，DNA大部分仍存在于细胞内，游离DNA的量相对较少。但在微量接触类检材中，游离DNA量虽少，却依然可达细胞内DNA量10%以上的比例，游离DNA获得的等位基因数可占总DNA获得等位基因数的30%以上。有些收集脱落细胞的方法，比如真空吸附等，会将游离DNA排除在外，导致提取到的接触DNA减少，从而降低检验成功率[40]。所以，改变提取方法以有效利用游离DNA将可提高PCR中DNA模板的量[41]。显然，直扩法可有效利用这种游离DNA，从而提高PCR成功率[4,38]。

5 快速PCR技术和直扩技术的联合应用

通过调整改进快速DNA聚合酶、热循环仪、扩增参数等条件可使直扩技术更快速。近年来部分商品化扩增试剂盒在扩增时间上较以往试剂盒明显缩短，如GlobalFiler Express试剂盒可40 min内完成扩增，而GlobalFiler试剂盒则需80 min。Verheij[46]使用PIKO热循环仪和 Phusion Flash聚合酶通过SGM Plus, IdentiFiler, SE filer, NGM四种试剂盒进行快速直扩，成功将血液、唾液、精液等检材的直扩时间缩短至47 min。Chen等[47]报道了一种基于铁丝的样本快速直扩方法，选用直径0.5 mm的无锈单股铁丝加热后插入到凝血块或其他人体组织中约5 mm, 转动5 s后取出即放入异丙醇中固定, 随后就直接放入PCR 反应液中进行扩增。这种方法可在案件现场简单快速地处理样本, 不仅可节省提取DNA的时间,还可达到长期保存样本的目的。Aboud[48]通过优化组合扩增仪、酶和缓冲液等条件，使对7个基因座的快速直接扩增缩短至16 min，样品的分型一致性达99.5%。刘琳[49]等联合运用Identi filer Plus试剂盒与TaKaRa快速PCR检测试剂构建快速直接PCR体系，以FTA血卡为模板材料，采用优化后的扩增程序在快速PCR仪上进行扩增, 所得STR分型结果与常规方法一致，扩增用时由常规直扩所需的175 min减至55 min。

6 直扩技术的影响因素

6.1 污染物

前述钱水[6]有对污染程度及检材情况对直扩影响的研究。另焦志[50]发现，在检材表面相对较洁净的情况下，直扩法相比M48法提取效果更好。

6.2 检材大小

相关文献取材大小一般集中于1.2、1.5或2 mm2范围之间[4,19]。焦志[50]证实，使用EZtape粘取法粘取手套类检材，由于粘膜表面粘取的杂质较多，且粘膜载体较大，加之粘膜性状也比较特殊，而直接扩增法体系又相对较小，故检材大小、表面洁净程度都会影响到后续的直接扩增，所以对于这类检材直接扩增效果没有M48提取纯化效果好。因此转移范围要结合个人经验适度把握，转移范围过大，PCR抑制物多，部分样本会出现峰值前高后低现象，峰型不均衡或出峰不全等问题，从而既影响对图谱的观察，又可能出现污染或混合数据；但转移范围过小则可能会因收集的细胞过少而检测不出。

6.3 抑制剂

一般情况下，大部分试剂盒在血红素、尿素、腐殖酸、色素、金属离子等抑制剂存在的情况下仍可成功扩增DNA，但牛仔布料上的一种靛蓝胭脂红染料会很容易导致扩增失败[51]。王传海发现对于肋软骨来说，为减少抑制剂的影响，取材时宜尽量选取中间部位，此外还可选择25μL扩增体系以降低抑制剂的浓度[33]。再者，试剂中若加入了抗抑制的物质，其与抑制物结合，虽不会影响PCR扩增，但却会减短毛细管的寿命。

7 直扩技术的局限与展望

与传统的分型方法相比, 直扩技术在很大程度上节省了人力、物力、财力及时间，但其在实际案件检验中的应用仍有待推广。目前对直扩技术的研究也大多集中于一些对前科人员的建库，虽常规案件检材和模拟案件检材也有涉及。在微量DNA检材越来越多的形势下，直扩技术中的很多问题需要进一步研究解决，比如扩增试剂和扩增程序的优化、检材的有效采集、扩增中的抑制物干扰、分型结果的稳定性和可靠性、检材的一次性使用消耗等。目前，市面上专门针对检案设计的直扩试剂盒还较少，而且对不同类型的检材直扩效果也不一样。将来随着DNA分型技术和相关研究的不断发展深入，以及使用更加优化的商品化直扩试剂盒进行多部位选取检材、平行扩增等改进措施，检验和分析结果的可靠性将会更有保证，出现混合分型的几率也会大大降低，这或许会给广大技术人员提供一种更加普遍适用的检验思路和模式，助推DNA检验在案件侦破中发挥更高效快捷的作用。