真菌纤维素酶表观遗传修饰的研究进展

郑春娟， 邓婷婷， 来亚鹏,2， 刘 刚， 王 娟*

（1. 深圳大学 生命与海洋科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东 深圳 518060；2. 深圳大学 生命与海洋科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，广东 深圳 518060）

纤维素酶是一个具复杂水解功能的酶系，能将纤维素水解最终生成葡萄糖。许多丝状真菌都能够产生丰富的纤维素酶系。在自然界中，真菌产生的纤维素酶分布最广，是降解木质纤维素的重要来源。此外，纤维素酶广泛应用于饲料酿造、食品加工、中草药有效成份提取、果蔬加工和石油开采等行业，有效提高了产品质量和产量，从而获得显著的经济效益。

纤维素酶的工业生产中，获得更高生产性能的菌株对于提高经济效益具有关键作用。研究表观遗传修饰对木质纤维素酶基因表达的调控，对提高生产中的酶活性具有重要理论意义和应用价值。本文综述近几年DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA的调控等表观遗传修饰方式在真菌纤维素酶的表达调控中的重要作用。

1 真菌纤维素酶的种类与结构

真菌产的纤维素酶可分为三大类：外切葡萄糖苷酶、内切葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶。1）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase），作用于β-1,4-糖苷键，每次切下纤维素线性分子末端一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶（β-1,4-D-glucan cellobiohydrolase或cellobiohydrolase，简称CBH）；2）内切葡萄糖苷酶（β-1,4-D-glucan-4-glucanohydrolases或 endo-1,4-β-D-glucannase，简称 EG），随机作用于不溶性纤维素表面 β-1,4-糖苷键，产生大量具非还原性末端的小分子纤维素；3）β-葡萄糖苷酶（β-D-glucoside glucohydrolases或β-glucosidase，简称 BG），可将纤维二糖甚至纤维三糖水解成葡萄糖分子。真菌中产生的三类酶的共同作用，可将纤维素水解为葡萄糖[1]。

几乎所有纤维素酶都是由一个是具有催化结构域（catalytic domain，CD）、结合结构域（cellulose binding domain，CBD）以及一个高度糖基化的连接肽（1inker）这三部分组成的[2]。CBH的CD可沿纤维素链向结晶区单方向持续催化产生纤维二糖[3]。研究表明CBH的CBD具有吸附纤维素，使纤维素聚合物氢键断裂形成短纤维的作用，有的纤维素酶没有CBD结构，但并不影响其水解功能[4]。Linker负责将纤维素酶的催化区连接到CBD上并把CD与CBD适当隔开以维持两边的相对活性。

2 真菌纤维素酶基因的表达调控机制

纤维素酶基因是一个多基因家族，每个基因都有其自身的转录调控因子，也有一些基因共享同一个转录因子。目前从里氏木霉（Trichoderma reesei，T·reesei）中鉴定出的纤维素酶基因相关转录因子有 ACE1、ACE2、CRE1和XYR1等[5-7]。ACE1与ACE2是纤维素酶基因转录调节因子，ACE1是三个C2H2锌指结构域的纤维素酶基因正转录调控因子，ACE2起负调控作用。CRE1是典型的碳源代谢阻遏抑制因子，如葡萄糖等简单单糖存在时，CRE1发挥阻遏作用。XYR1是cbh1、cbh2、egl1、bgl1、xyn1和xyn2等主要纤维素酶和半纤维素酶基因转录所必须的激活因子[8]。研究表明，在里氏木霉中，cbh1编码纤维二糖水解酶CBH1，egl1编码内切β-1,4-葡聚糖酶EGL1[6]。在里氏木霉中已经发现至少有上面4个转录因子参与调节cbh1启动子。有研究发现，在红褐肉座菌（H. jecorina）中蛋白复合物Hap2 /3 /5也参与cbh2基因的表达，但具体作用未见详述[9]。

纤维素酶基因的转录是主要由纤维素及其衍生物（纤维二糖和槐糖）、乳糖和单糖山梨糖诱导的，并受制于碳源代谢阻遏。已有研究表明，XYR1、ACE2和ACE1基因的表达都是由乳糖诱导的。XYR1也由D-半乳糖诱导，但这种诱导与D-半乳糖代谢无关[7]。

3 表观遗传修饰在真菌纤维素酶基因调控中的作用

表观遗传机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑、非编码RNA的调控等，这些机制相互作用形成特定功能所需的特异染色质，以调节基因表达[10]。DNA甲基化是研究最多的表观遗传修饰之一，它通常使基因表达受到抑制[11]。组蛋白修饰包括组蛋白的甲基化与去甲基化、乙酰化与去乙酰化等。乙酰化是目前研究的最深入的与转录有关的组蛋白修饰方式。参与维持组蛋白乙酰化平衡的主要酶是组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDACs）和组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HATs）。而非编码RNA的调控包括siRNA（small interfering RNA）、miRNA（micro RNA）以及长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）的调控作用。

一般认为，在真核生物主动转录的基因与组蛋白H3和H4的不同赖氨酸残基上的乙酰化以及转录活跃指示区H3K4的甲基化有关。近年来，有关表观遗传修饰在真菌纤维素酶基因表达调控中作用的研究不断深入。

3.1 DNA 甲基化对纤维素酶表达的影响

DNA甲基化在哺乳动物、植物和真菌中都是重要的表观遗传标记。相关研究发现，仅粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、多头绒泡菌（Physarum polycephalum）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、布拉克须霉（Phycomyces blakesleeanus）等少数真菌胞嘧啶甲基化程度较高[12]。真菌DNA甲基化位点与植物相同，主要位于转座子和其他重复序列，进而控制基因的表达与沉默。

在粗糙脉孢菌中首次发现重复序列诱导的点突变（repeat induced point mutation，RIP）以及在粪盘菌（Ascobolus immersus）中发现的减数分裂前诱导的甲基化（methylation induced premeiotically，MIP）均是通过与转座子或其他重复序列结合，发送甲基化信号[13-14]。在粗糙脉孢菌和粪盘菌中，组蛋白H3的胞嘧啶甲基化和典型异染色质区域H3K9的三甲基化参与异染色质形成[15-16]。在真菌中，转座子只要长度足够被RIP或者MIP结合，均被高度甲基化。已有研究证明，甲基化相关的沉默是通过阻止这些真菌中的转录延伸发挥作用的[17]。目前为止，真菌中已发现的5种DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DMT）。在粗糙脉孢菌中发现的DIM-2可持续或从头甲基化转座子，这些DNMTs中的任何一种的突变在表型中都没有表现出明显的缺陷[14,18-19]。

近年来，化学修饰试剂成为研究真菌甲基化机制的重要手段。周娇娇等在含0.1 mmol/L 5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-2ʼ-deoxycytidine , 5ʼ-Aza）的培养基中培养里氏木霉T.reesei QM9414，发现该菌株DNA甲基转移酶表达比出发菌株明显降低，全基因组DNA甲基化程度也有下降，cbh1、egl1和xyr1 基因表达水平增加。经酶活测定发现羧甲基纤维素钠酶活性（carboxymethyl cellulose-Na enzymatic activities，CMCA）以及滤纸酶活性（filter paper enzymatic activities，FPA）明显增加[20]。同样，5ʼ-Aza刺激灰霉病酶（Humicola grisea var. thermoidea，Hgvt）96小时后木聚糖酶活性增加。在含葡萄糖（Glu）培养条件下，发现5ʼ-Aza使Hgvt细胞生物水解酶和XYN-2木聚糖酶基因的转录积累增加，而在小麦麸皮（WB）上培养时，检测到5’-Aza增强了转录因子CreA基因的表达[21]。

上述研究表明，DNA甲基转移酶抑制剂 5ʼ-Aza可能是通过作用于调节纤维素酶基因表达调控因子ACE1、ACE2、CRE1和XYR1等的表达，进而在转录水平上影响纤维素酶以及木聚糖酶基因的表达。

3.2 蛋白甲基转移酶对纤维素酶表达的影响

蛋白甲基转移酶LaeA是一种广泛的调节因子，对几种真菌多种次生代谢物基因簇的表达产生影响。在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）中，LaeA、VeA 以及VelB共同构成VELVET蛋白复合物，LaeA有修饰异染色质结构的作用[22]。在草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）中，LaeA不仅调节糖苷水解酶基因的表达，而且调节糖苷水解酶相关重要转录因子基因clrB、xlnR和creA的表达。在laeA基因座上引入野生型laeA拷贝后，laeA突变株的生长缺陷和纤维素酶合成缺陷得到了恢复。但laeA基因突变激活了β-木糖苷酶基因 xyl3A的表达，胞外木糖苷酶活性提高了 5倍以上，表明 LaeA对胞外木糖苷酶的形成有负调控作用[23]。

研究发现，里氏木霉中LaeA直系同源物蛋白质甲基转移酶LAE1是性发育的调节器，同时又调节纤维素酶和多糖水解酶的表达[24]。Seiboth B等在乳糖诱导的条件下，敲除lae1基因的里氏木霉菌株纤维素酶活性比亲本菌株显著降低。以木聚糖为碳源时，lae1基因突变体中木聚糖酶活性亦显著降低。研究发现，LAE1可控制糖苷水解酶基因和转录激活因子 XYR1基因的表达，同时调控碳水化合物酶类（CAZymes）基因家族的表达，但并不直接甲基化CAZymes编码区的H3K4或H3K9。纤维素酶基因表达的LAE1依赖性与诱导无关[25]。表明在里氏木霉中，几乎所有纤维素酶的表达都依赖于LAE1。目前，蛋白甲基转移酶LAE1甲基化的靶蛋白在任何生物体中均未被鉴定[26]。

VeA是调节多种真菌的形态发生和次生代谢的基因，在黄曲霉（Aspergillus flavus）中，VeA是淀粉酶和蛋白酶活性依赖性调节因子[27]。在里氏木霉中，VeA的直系同源物是 VEL1。VEL1突变体在乳糖作为纤维素酶诱导碳源的培养基上进行培养，纤维素酶、木聚糖酶和纤维素酶正调控因子XYR1被完全破坏，这表明VEL1对于纤维素酶等多种酶的形成是必需的[28]。

LaeA以及VeA在纤维素酶表达调控中具有重要影响，由于LaeA及其同源物在次生代谢和其他生物技术中的重要性，LaeA成为生物技术重要真菌菌株改良的主要焦点。

3.3 组蛋白乙酰化、甲基化对纤维素酶表达的影响

HAT家族成员组蛋白乙酰化酶编码基因gcn5最初在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中被鉴定出来。Xin等对gcn5在里氏木霉中的同源基因TrGcn5进行突变，羧甲基纤维素（CMC）或结晶纤维素诱导下重组菌株中无明显的纤维素酶表达异常，但在乳糖诱导条件下，表现出极低的 CBH酶活，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果证明 cbh1基因的转录激活几乎被消除，而另外两个糖苷酶编码基因的转录不产生影响。进一步研究发现，TrGcn5可能通过乙酰化纤维素酶基因启动子中特定的组蛋白尾部使染色质重塑，进而调控其转录激活[29]。

在水稻恶苗病菌（Fusarium fujikuroi）中，蛋白复合物VELVET由Vel1、Vel2以及Lae1构成。Lae1是LaeA的直系同源物，主要参与次级代谢基因簇的调控，但也影响基因的表达编码转绿因子、组蛋白修饰物、转运蛋白和几种其他功能型蛋白质。Lae1突变体中过表达组蛋白乙酰转移酶HAT1导致某些生物合成的部分恢复，表明HAT1在水稻恶苗病菌中可能与Lae1参与相同的调节网络[30]。周娇娇等在里氏木霉中敲除编码组蛋白H3赖氨酸甲基转移酶（histone H3 lysine methyltransferase，HKMT）以及组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的基因后，组蛋白的甲基化修饰与去乙酰化修饰被抑制，同时荧光定量 PCR检测到 cbh1、egl1与 xyr1基因的表达水平显著增加，明显纤维素酶的表达被激活[31]。结果表明HKMT和HDAC均参与调控里氏木霉纤维素酶基因的转录和表达。

Ba Van Vu等发现纤维素酶基因表达存在双向调控机制。在 2%CMC诱导培养下，稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中编码纤维素酶的基因MoCel7C（MGG_14954）转录物的水平相比出发菌株增加超过1 000倍，而在MoSET1基因突变体在非诱导条件下的MoCel7C表达水平也增加。葡萄糖和纤维二糖抑制了CMC诱导的MoCel7C启动子的活化，而MoCel7C基因座的H3K4甲基化也与CMC对该基因的激活有关。此外，在米曲霉（M.oryzae）中，组蛋白赖氨酸甲基转移酶MoSET1基因直接或间接地在MoCel7C基因的激活和抑制中起作用。不溶性结晶纤维素在琼脂培养基上活化了MeCel7C启动子，但不在液体培养基中活化，表明需要通过诱发真菌菌丝体来激活MeCel7C启动子[32]。

3.4 非编码RNA研究

3.4.1 siRNA

RNA干扰（RNAi）是一种自然发生的转录后基因沉默现象，在基因组中，重复序列转录产生的单链异常RNA（aberrant RNA，aRNA），被复制后生成双链RNA（dsRNA），并在核糖核酸内切酶Dicer的作用下被剪切形成siRNA，siRNA随之引发RNA干扰基因的正常表达。RNAi技术可以在降低基因表达量的同时，几乎不会对真菌生长产生系列严重反应或致死，因而RNAi可用于对转录因子调控的研究[33]。

目前，RNAi在真菌纤维素酶基因表达调控研究中应用逐渐增加。但大部分使用的是长链RNAi技术以及诱导型干扰载体。利用 RNAi技术干扰纤维素酶高产突变体康宁木霉（T. koningii YC01，GenBank:JQ291608）的 cre1基因的表达，发现 cre1的部分沉默导致木聚糖酶和纤维素酶调节因子 XYR1的表达升高[34]。

在对其他阻遏因子ACE1的基因不产生影响的条件下，表达组成型siRNA载体干扰里氏木霉碳阻遏抑制因子cre1后，cre1基因的表达下降50%，在第6天时，cre1干扰重组菌中的cbh1、egl1和xyr1的表达量相比亲本菌株提高2倍左右，纤维素酶活力也高于出发菌株，说明干扰cre1可以解除阻遏物对部分纤维素酶基因表达的抑制[35]。王榕等将里氏木霉利用RNAi技术下调cre1基因的表达后，在转化子中发现内切纤维素酶和外切纤维素酶的酶活均有显著提高，但β-葡萄糖苷酶的活性有所下降。在里氏木霉中，β-葡萄糖苷酶活性主要取决于于bgl1基因，表明cre1基因可能直接或间接影响bgl1的表达[36]。本实验室的Yang等人利用RNAi技术分别干扰嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila）中的ace1基因和转录因子cre1基因，证明了ace1在嗜热毁丝霉纤维素和半纤维素酶表达中的负调控作用，对cre1干扰转化子的研究发现，CRE1在嗜热毁丝霉中对正调控因子XYR1的表达无影响[37-38]。

RNA干扰技术不仅可以干扰转录因子，也可以作用于转录相关的重要酶基因表达。周娇娇等对里氏木霉 gcn5进行干扰后，发现干扰转化菌株中组蛋白乙酰化修饰被明显抑制，使得纤维素酶表达调控相关基因表达量显著下降，从而导致纤维素酶活的下降[30]。进一步证明组蛋白乙酰化酶在调控里氏木霉纤维素酶基因的转录和表达中发挥了重要作用。值得肯定的是，针对纤维素酶负调控因子设计的siRNA干扰载体，能在对菌株生长发育产生最低影响的条件下，进一步提高真菌中相关纤维素酶的产量。

3.4.2 长链非编码RNA研究

长链的非编码RNA（LncRNA）是一类转录本超过200 nt的RNA分子，可通过与特异mRNA结合形成双链，在Dicer酶的作用下产生siRNA。在表观遗传机制中，LncRNA能招募染色质重塑复合物到特定位点从而导致相关基因的沉默。之前，在真菌中，仅在酵母中发现LncRNA的存在[39]。

2018年，Petra等在丝状真菌里氏木霉QM9414中首次发现了一个被3’聚腺苷化的LncRNA，被称为HAX1。HAX1仅存在于里氏木霉，并且在不同菌株QM6a、QM9414和Rut-C30中具有不同的长度，可能与其进化程度有关。在QM9414中，hax1突变体中纤维素酶表达降低，过表达hax1后得到恢复，表明HAX1参与调节纤维素酶表达。在QM6a中，发现HAX1的缺失并不影响表型，表达hax1后纤维素酶活性显著提高[40]。

4 展望

在真菌中，纤维素酶的表达受到诱导物、转录调控因子、碳源代谢阻遏作用等多重因素的影响。全面了解纤维素酶基因表达调控的各种因素及其相互作用，可提高纤维素酶产量、构建出具有更高酶活的纤维素酶基因工程菌。表观遗传修饰作为基因表达调控的重要方式，在纤维素酶表达过程中发挥着重要作用。

目前，关于表观遗传修饰在真菌纤维素酶表达调控方面的研究仍相对较少，尚有许多不足。例如，虽然越来越多的研究结果表明，蛋白甲基转移酶 LAE1或其同源物在多种真菌中其参与纤维素酶表达调控，但其甲基化的靶蛋白有待研究；蛋白复合物VELVET的功能值得深入挖掘；在纤维素酶基因调控中DNA甲基化以及组蛋白修饰的具体作用机制仍不明确；许多调控基因的甲基化状态以及组蛋白修饰位点未知。对于上述问题的深入研究，将有利于人们深入理解表观遗传修饰对纤维素酶表达的作用机制，进一步揭示纤维素酶表达调控的机理。