口蹄疫液相阻断ELISA实验中常遇问题及详细操作步骤

王秀东，邹德颖，郭兴，那永东，翟伟，曹凯捷

（盘锦检验检测中心，辽宁 盘锦 124010）

酶联免疫吸附实验(ELISA) 是一种用酶标记已知的抗原或抗体，并使之吸附在固相载体表面发生抗原抗体反应，用于检测大分子抗原和特异性抗体的技术[1]。在口蹄疫病毒抗体检测中，液相阻断ELISA实验是农业部规定的检验标准，判定结果较为客观，而且能够有效评价接种了FMD疫苗的动物的抗强毒攻击能力。由于酶联免疫吸附实验步骤较为复杂，且环环相扣，一旦某个环节出现问题，将影响到实验结果的准确性，因此必须明晰其实验流程及注意事项。

1 口蹄疫液相阻断ELISA实验中常遇问题

相对来说，口蹄疫液相阻断ELISA实验的过程是比较漫长的，实验者常遇到以下几个问题：①说明书过于精要，实验步骤不明晰，导致实验流程混乱，操作不严谨，还有可能会出现实验过程中用错试剂的情况；②在抗原抗体反应中，需要用到96孔U型板进行血清稀释，有时候实验者会将ELISA反应板与之混淆；③在抗原抗体反应稀释血清的环节，实验步骤较复杂，而且要两次调整移液器量程，如果没有按照实验步骤调整刻度值，将导致所加PBST液量错误，继而导致稀释倍数计算错误；④酶联免疫吸附板条未牢牢固定在板架上，在洗板甩干/脱干的环节容易脱落，如果之前未加标记，很容易分不清样品序号顺序 。

针对上述情况，可采取以下措施有效避免：①仔细阅读说明书，揣摩其中含义。逐字逐句阅读说明书，对于有疑问或不理解的词语，应自己查阅资料了解，如果不明确实验步骤，可以询问实验经验丰富的人，直到基本掌握实验操作步骤；②做好实验准备工作。在实验中，所用实验器材有5～50μL的单道移液器及多道移液器、50～300μL的多道移液器、、加样槽、废弃液瓶，以及20mL、50mL、250mL、500mL量筒，以及300mL、500mL烧杯，准备好足够数量的实验器材，检查试剂是否齐全，根据实验人员数量准备足够的96孔U型反应板。

2 口蹄疫液相阻断ELISA实验详细操作步骤

2.1 配备PBST液

一般情况下，一板实验需要用到500mL1倍PBST液，因此可根据实验板书计算药液用量，再使用25倍PBST浓缩液配置1倍PBST液。检查25倍PBST浓缩液平底有无结晶，如无可直接稀释，若有则置入水浴锅中直至结晶融化再稀释，20mL量筒量取20mL浓缩液，倒入500mL量筒中，加蒸馏水至500mL刻度线，混匀，倒入加样槽内。

2.2 抗原抗体反应

实验过程的具体步骤如下：①稀释血清。以每板检测10份血清为例，取洁净的96孔U型反应板，采用50～300μL的多道移液器，刻度调至75μL，吸取1倍PBST液加入A1～A10孔中；刻度调整至50μL，往A～H行的1～11列孔、A12、B12中加入1倍PBST液。使用5～50μL的单道移液器，吸取25mL检测血清，加入A1～A10孔中；将多道移液器的刻度调整至50μL，插入A1～A10孔中反复吸取数次，混匀，再吸取50μL药液，加入到对应的B列孔中，重复上述操作，将同一列的液体50mL吸取到下一行的孔中，直至H列，最后吸取50μL药液弃去，使得从A列到H行，血清稀释倍数依次为1∶4、1∶8……1∶512。在A11孔加入阳性血清50μL，采用相同的方式进行稀释，使其稀释倍数为1∶16、1∶32……1∶2048，在A12孔中加入阴性血清50μL，稀释至B12，稀释浓度分别为1∶2、1∶4；②添加病毒抗原。通常一板实验需要5mL抗原，根据实验板数计算工作浓度抗原数量，根据实际浓度，稀释抗原，并多配置2～3mL备用，按照说明书的要求加入反应板孔中，封板，轻微振荡，37℃恒温箱中放置90min。

2.3 余下实验步骤

在抗原抗体实验后，所需进行的实验步骤有：①转移抗体抗原混合液，根据说明将抗原抗体混合液转移至口蹄疫O型、A型或者亚洲I型相应的ELISA反应板中，每孔50μL，封板，37℃恒温箱中温育60min；②洗板。弃掉ELISA板中液体，移液器吸取1倍PBST液260至280μL置入孔中，再甩出，重复3～5次，吸水纸拍干；③添加口蹄疫O型或A型豚鼠抗体。往ELISA板各孔中加入ELISA板中50μL口蹄疫O型、A型或者亚洲I型豚鼠抗体，封板，37℃温育30min；④洗板；⑤加兔抗豚鼠酶结合物；⑥加底物；⑦加终止液，记录酶标仪刻度值。

3 结语

口蹄疫液相阻断酶联免疫吸附实验步骤繁多，如果做实验的人不严格按照实验步骤进行操作，很有可能得到不成立的实验结果，前功尽弃，影响到病毒抗体检测工作效率及质量[2]。对于实验者，尤其是初学者，在做实验之前，最好能够详细阅读说明书，不放过其中的任何一个字眼，仔细揣摩其中的意思，直到能够记住实验步骤及其中的一些注意事项。

[1]李世凤,吴得瑞.浅析影响口蹄疫O型液相阻断ELISA实验的因素[J].中兽医学杂志,2017,(01):72.

[2]王娟娟.口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测两种实验方法结果对比[J].吉林畜牧兽医,2017,38(08):5-6.