靶向抑制高表达HRR蛋白增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性

朱佳蓓，黄 楠，崔中奇，杨庆源，潘秋辉

（1.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科，上海 200127；2.同济大学附属上海第十人民医院检验科，上海 200072）

DNA双链损伤（double-stranded break，DSB）是最严重、最难修复的DNA损伤，是导致基因组不稳定和细胞死亡的主要原因[1]。同源重组修复（homologous recombination repair，HRR）通过精确修复DSB，维持正常细胞基因组的完整性和稳定性，是细胞发挥基本功能及维持生存的必要条件。正常细胞中HRR蛋白的缺失可导致基因组的严重不稳定，染色体突变增加，启动细胞癌变[2]。放化疗是临床治疗肿瘤的常用手段，其机制是通过射线、药物诱导细胞发生DSB，激活凋亡途径，致使肿瘤细胞死亡[3]。有研究证实，某些HRR蛋白在肿瘤细胞中高表达，高表达的HRR蛋白通过参与放化疗导致的DSB修复，介导损伤耐受并抑制凋亡途径，激活增殖信号通路，维持了肿瘤细胞基因组的完整性和稳定性，使肿瘤细胞对放化疗耐受，得以继续存活[4-5]。因此，这类高表达的HRR蛋白促进了肿瘤的形成与发展，它们有可能成为肿瘤精准治疗的新靶点。为此，本文对肿瘤细胞中高表达的HRR蛋白如何促进肿瘤的发生、发展作一综述。

1 HRR

HRR是指受损DNA以细胞内同源染色体相对应的序列作为模板，进行损伤修复的过程。此过程由Nijmegen断裂综合征1（Nijmegen breakage syndrome 1，NBS1）-减数分裂重组蛋白11同源物A（meiotic recombination 11 homolog A，MRE11）-DNA修复蛋白50（DNA repair protein RAD50，RAD50）（简称MRN）复合物、乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）、乳腺癌易感基因2（breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2）、重组蛋白A（recombination protein A，RecA），X射线修复交叉互补基因2（X-ray repair crosscomplementing gene 2，XRCC2）等一系列关键的HRR蛋白协同完成。

MRN复合物是HRR的核心效应分子，当DSB发生后，MRN复合物可以迅速感应损伤信号，定位于双链损伤处，并将共济失调毛细血管扩张症突变激酶（ataxia-telangiectasia-mutated kinase，ATM）招募到损伤位点，ATM通过与MRN复合物相互作用发生自身磷酸化，形成磷酸化ATM（phosphorylated ATM，pATM）[6]。pATM可以将断裂处的组蛋白H2AX磷酸化成γH2AX，将损伤信号放大，从而招募更多的修复蛋白如RAD51、BRCA1、BRCA2等到DSB损伤位点。MRN复合物和BRCA1共同参与受损DNA 5'-末端的切除，产生了3'-末端突出的单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）[1]，复制蛋白A（replication protein A，RPA）随后结合于ssDNA 3'-末端，RAD51在BRCA2、XRCC2等重组调节蛋白的作用下置换出RPA，并与ssDNA 3'-末端结合形成核蛋白纤维结构。同时RAD51可寻找、识别另一段与受损DNA同源的序列，并且刺激该ssDNA侵入同源DNA双链进行配对和链交换，并在其他酶的作用下，完成DSB修复[2]。

2 肿瘤细胞中起癌基因功效的HRR蛋白

2.1 NBS1

NBS1基因位于人染色体8q21上，其编码的蛋白N末端的叉头相关结构域（forkhead- associated domain，FHA）与BRCA1 C末端结构域（carboxylterminal domain of BRCA1，BRCT）在HRR和激活G2/M期检查点中发挥重要作用[7]，能够维持正常细胞基因组的稳定性。NBS1通过其C末端区域与MRE11、RAD50形成MRN复合物，其中心区序列介导NBS1被ATM特异性磷酸化，从而传递损伤信号[1]。NBS1缺失使得RAD50、MRE11无法定位于损伤位点，正常细胞内发生的DSB难以修复，大大提高细胞癌变的概率，因而NBS1以往被认为是一种抑癌基因。

然而，有研究结果显示，NBS1在非小细胞肺癌、食管癌等不同类型的肿瘤中呈高表达。高表达的NBS1通过参与HRR维持了肺癌细胞基因组的稳定性，并通过提高生长因子受体下游分子磷脂酰肌醇激酶的活性，导致蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）磷酸化水平升高，从而促进肺癌细胞增殖、肿瘤的形成与侵袭[8]。此外，在人头颈部鳞状细胞癌的裸鼠模型中转基因表达突变NBS1，发现其通过下调NBS1表达干扰MRN复合物的修复功能，从而增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，使肿瘤体积明显缩小[9]。另外，MRN复合物抑制剂OBP-301能够增强肿瘤细胞对放疗的敏感性[10]。

2.2 MRE11

MRE11是MRN复合物的重要组分，具有3'~5' DNA双链外切酶活性、单链DNA内切酶活性，其通过激活核酸外切酶1（exonuclease 1，EXO1）的5'~3' DNA双链外切酶活性，参与受损DNA 5'-末端的剪切，促进HRR过程[11]。

有研究结果显示，MRE11的蛋白水平与乳腺癌恶性程度、复发与转移呈正相关，高表达MRE11的乳腺癌细胞通过提高信号传导、转录激活因子3（signal-transducer and activator of transcription 3，STAT3）的磷酸化水平和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）水平，促使该类细胞增殖、迁徙和侵袭；同时这类细胞也具有较强的修复放疗引起的DSB活力，使其在放疗后得以存活，这是乳腺癌复发率增加、患者生存率下降的主要原因之一[12]。此外，动物实验证实MRE11突变增强了抗肿瘤药物胸苷和喜树碱对结肠癌的抑制作用[13]。有研究结果显示，MRE11的靶向抑制剂——腺病毒蛋白E4orf3和E4orf6可通过阻碍DSB修复，增强放疗对肿瘤细胞的杀伤作用[14]。

2.3 BRCA1

BRCA1基因位于人染色体17q21，其突变提高了患乳腺癌和卵巢癌的风险，因而BRCA1过去被认为是一种抑癌基因[15]。BRCA1蛋白通过N末端环结构域与BRCA1相关环状蛋白（BRCA1-associated RING domain protein，BARD1）组成的异二聚体可以抑制肿瘤的形成[16]。BRCA1 C末端BRCT结构介导了其与受体相关蛋白80（receptorassociated protein 80，RAP80）的间接结合[16]。当DNA损伤发生后，RAP80通过参与泛素依赖的信号途径，将BRCA1招募到DNA损伤位点，共同参与HRR并激活G2/M周期检查点，以维持正常细胞基因组的稳定性，从而阻止细胞癌变[17]。

然而，有研究结果显示，BRCA1在胶质母细胞瘤中呈高表达，高表达的BRCA1通过调控核糖核苷酸还原酶催化亚基的转录水平，保护其DNA不受内源性复制压力的损伤，抑制凋亡途径，促进肿瘤的发生与发展；而稳定敲除肿瘤细胞中的BRCA1可以抑制抗肿瘤药物羟基脲引发的复制叉停滞的恢复，从而促进其凋亡[18]。此外，在胰腺癌动物模型中发现BRCA1突变能够抑制HRR，从而加剧吉西他滨和顺铂导致的DSB积聚，因此靶向胰腺癌细胞中的BRCA1能够增加该细胞对化疗药物的敏感性[19]。BRCA1的抑制剂——细胞透性蛋白-蛋白相互作用抑制剂能够有效提高宫颈癌细胞对放疗的敏感性[20]。

2.4 RAP80

RAP80基因位于人染色体5q35上，其编码蛋白的氨基端含有2个泛素相互作用模体（ubiquitin-interacting motif，UIM）。RAP80蛋白可以通过UIM基序特定识别赖氨酸第63位残基K被泛素修饰过的γH2AX，使DNA损伤信号放大[21]。UIM结构域也介导了BRCA1、RAP80、卷曲螺旋结构域蛋白98（coiled-coil domaincontaining protein 98，CCDC98）、乳腺癌易感复合物亚基36（BRCA1/BRCA2-containing complex subunit 36，BRCC36）等修复蛋白复合物的形成[16]，促使RAP80招募多种修复蛋白到DNA损伤位点，参与HRR过程，从而维持细胞基因组的稳定性与复制的精准性，进而抑制细胞恶变。

但有研究结果显示，在宫颈癌细胞中过表达RAP80可以提高雌激素受体α（estrogen receptor alpha，ERα）蛋白水平，促进肿瘤的发生、发展[22]。此外，还有研究结果显示RAP80在胰腺癌中呈高表达，高表达RAP80的胰腺癌细胞具有较强的修复活力，能够修复化疗药物引起的DSB，导致其对化疗药物吉西他滨的敏感性下降，而RAP80缺失的胰腺癌细胞通过调控死亡受体途径中BCL-2相关X蛋白（BCL2-associated X，BAX）以及B淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）的表达，促进胰腺癌细胞凋亡[3]。

2.5 RAD51

RAD51是大肠埃希菌重组酶A（recombinase A，RecA）的真核细胞同源物，具有启动DNA同源序列的查找、配对及链交换的功能，是HRR不可或缺的组分[23]。

有研究结果显示，RAD51蛋白在三阴性乳腺癌中呈高表达，体内、体外实验均证实高表达的RAD51通过促进HRR，降低了肿瘤干细胞对聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶1[poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1]抑制剂奥拉帕尼的敏感性，从而导致肿瘤的转移和复发；稳定敲除乳腺癌细胞中的RAD51后，能够有效地减弱该类细胞抵抗PARP1抑制剂的能力，进而激活凋亡途径，使肿瘤生长受到明显抑制[24]。此外，有临床研究证实RAD51的小分子抑制剂B02通过阻碍HRR增强了多发性骨髓瘤细胞对抗肿瘤药物阿霉素的敏感性[25]。

2.6 XRCC2

XRCC2基因位于人染色体7q36.1上，其编码的蛋白是RecA RAD51亚家族的成员之一。XRCC2通过与RAD51C、RAD51D等RAD51类似物形成复合物，聚集于复制叉及Holliday连接体，促进RAD51介导的同源序列配对及链交换，是HRR通路中的核心成分[26-27]，因而能够有效地减少染色体突变，从而阻止细胞恶性转化。

然而，有研究结果显示XRCC2蛋白在直肠癌中高表达，高表达XRCC2的肿瘤细胞可以修复电离辐射引起的损伤，使肿瘤细胞在放疗后存活，促进直肠癌发展[28]。此外，有研究结果显示，稳定敲除XRCC2后，停滞在G2/M期的结肠癌细胞增多，同时凋亡途径被激活，使得该类细胞对射线更敏感，从而抑制结肠癌的生长[29]。因此，XRCC2或许可成为解决肿瘤细胞放疗耐受性的潜在靶点。

2.7 微囊蛋白1（caveolin-1，Cav-1）

Cav-1基因位于人染色体7q31.1上， 其编码的蛋白是细胞膜穴样内陷中的主要结构蛋白，参与了HRR通路。当DSB发生后，Cav-1通过抑制蛋白磷酸酶2的活性，激活由ATM磷酸化开始的修复途径，同时促使BRCA1在损伤位点的进一步聚集[30]，在维持细胞基因组的完整性中发挥重要作用。

然而，有研究结果显示，在Cav-1高表达的胰腺癌中，Cav-1促进了胰腺癌细胞的增殖、侵袭与迁徙。通过RNA干扰技术敲除胰腺癌细胞中的Cav-1后，Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）-STAT3细胞生存信号通路受阻，随即通过活化内源性凋亡途径，使细胞增殖活力减弱、凋亡增加[31]。此外，胰腺癌细胞中Cav-1的表达在经过放疗后发生转录依赖性的上调，进而保护细胞抵抗基因毒性应激[32]，因此人工诱导Cav-1缺陷能有效增加肿瘤细胞对放疗的敏感性。

3 肿瘤干细胞中的HRR蛋白

肿瘤干细胞是肿瘤组织中极少数具有干细胞特性，即自我更新、无限增殖、多分化潜能的细胞群[33]。有研究结果显示，在多种肿瘤中，呈现干细胞特征的肿瘤细胞群HRR活性增强，是导致其抵抗放化疗、肿瘤复发和转移的重要原因[34]。大肠癌细胞中高表达的NBS1、RAD51D以及乳腺癌细胞中高表达的RAD51均介导了肿瘤干细胞对放化疗的耐受性[24，26]。因此，通过抑制HRR蛋白可以有效地阻断肿瘤干细胞的损伤后修复，进一步提高肿瘤患者的放化疗疗效。

4 总结和展望

HRR有助于维持正常细胞基因组的稳定性与复制的精准性，从而抑制肿瘤的发生。现有的研究结果揭示某些HRR蛋白在肿瘤细胞中表达显著增加，这类HRR蛋白在维持肿瘤细胞基因组稳定性中同样具有重要作用。它们通过参与放化疗诱导DSB的修复耐受损伤，或抑制凋亡，或激活增殖相关信号通路，起到了癌基因的作用，使肿瘤细胞继续存活，促进了肿瘤的发生、发展。肿瘤细胞对放化疗耐受是肿瘤治疗失败、复发与转移的主要原因，而肿瘤干细胞中高表达的这些HRR蛋白具有极强的HRR活力，提高了其抵抗放化疗的能力。这类在肿瘤细胞中高表达的HRR蛋白为肿瘤的精准个性化治疗、解决放化疗耐受问题带来了新思路，通过药物抑制HRR蛋白的表达，使肿瘤细胞在经过放化疗后DNA发生不可修复的破坏，继而激活凋亡机制，有效地增加肿瘤细胞对放化疗的敏感性，从而使肿瘤细胞死亡。因此，更为透彻地了解HRR蛋白在肿瘤细胞中的作用对指导临床用药、改善肿瘤的预后等均具有重要意义。