血栓调节蛋白基因甲基化修饰与脑梗死发病关系的研究

(1 深圳市龙岗区第二人民医院内一科，广东 深圳 518000； 2 深圳市福田区慢性病防治院新沙社区健康服务中心)

脑梗死是一种严重脑血管疾病，致死率和致残率较高，因此，早预防和早干预对于改善病人预后极为重要[1]。迄今为止，脑梗死的发病机制尚不明确，但是血管壁结构和功能性病变、血流动力学异常、血栓前高凝状态被认为是脑梗死发病最主要的病理基础[2-5]。研究显示，大多数脑梗死病人血栓形成前普遍存在凝血以及纤溶系统失衡[6]，而血栓调节蛋白(TM)在减轻血管内皮损伤和维持凝血-纤溶平衡方面发挥着重要的作用[7]。若TM水平下降，则反馈性地激活凝血系统，造成体内高凝状态，从而增加脑梗死的发病风险[8]。考虑到TM基因特殊的结构特征，在启动子区域含有多个CpG岛，易受到甲基化调控，因而沉默TM基因的表达，可抑制其抗凝、促纤溶作用[9]。国内外有研究显示，冠心病病人或肿瘤组织中TM基因启动子区容易发生异常高甲基化[10-11]，但是目前关于TM与脑梗死发病和严重程度的相关性研究较少，且存在一定的争议。本项研究旨在从表观遗传学角度探讨TM基因启动子区域甲基化状态与脑梗死的相关性，为进一步探讨脑梗死的发病机制和治疗方法提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2017年1—12月在我院住院治疗的脑梗死病人共96例，其中男59例，女37例；年龄39～82岁，平均(64.67±10.19)岁。颅脑MRI-弥散加权成像检查梗死灶直径<15 mm者为腔隙性脑梗死组(B组)，直径15～50 mm者为中等面积梗死组(C组)，直径>50 mm者为大面积梗死组(D组)。病人入选标准：①所有病人入院24 h后经颅脑MRI或CT扫描显示脑组织出现梗死灶；②符合《中国急性期缺血性脑卒中诊治指南(2014版)》关于脑梗死的诊断标准[12]；③发病时间均不超过48 h。病人排除标准：①不符合上述纳入标准的受试者；②混合型脑卒中(梗死后出血或出血后梗死)者；③心源性脑栓塞者；④由药物、外伤、脑血管瘤、脑血管畸形等引起的脑梗死者；⑤合并恶性肿瘤、血液系统疾病、免疫系统疾病、急性感染者；⑥合并严重肝肾功能障碍者。另外，选取同时期在我院体检中心进行健康体检的志愿者38例(A组)作为健康对照，经体格检查、颅脑MRI或CT扫描、血常规、心电图检查正常。本研究获得本地伦理委员会研究批准，病人知情并同意参与本研究。

1.2 血标本的采集

采集所有受试者清晨空腹外周静脉血5 mL，其中1 mL置于含有依地酸二钠(EDTA-Na)抗凝剂的采血管中，用于检测病人相关的生化指标；其余血液样本置于-70 ℃低温保存，用于进行相关DNA的提取。

1.3 生化指标检测

由我院检验科采用迈瑞BS350全自动血液生化分析仪(中国迈瑞)检测血清中三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、空腹血糖(FPG)等指标的水平。采用ELISA方法检测血清同型半胱氨酸(hcy)的水平，ELISA试剂盒购自上海蓝基生物技术有限公司。

1.4 TM基因启动子区甲基化检测

①采用AxyPrep-96血液基因组DNA小量抽提试剂盒(上海百赛生物技术有限公司)从全血样本中提取DNA。②采用EZ DNA Methylation-GoldTMkit修饰试剂盒(上海百赛生物技术有限公司)检测基因组DNA甲基化水平。③巢式甲基化特异性聚合酶链式反应(nMSP)：根据NCBI数据库获得的资料设计引物，甲基化特异性引物以及非甲基化特异性引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。④将样本经亚硫酸氢钠处理，采用非特异性引物进行首轮扩增；⑤然后以第一轮产物作为第二轮扩增的模板，进行第二轮特异性引物扩增，并将退火温度调整为59 ℃，以避免非特异性PCR产物的出现。将20 μL反应体系(Taq Mix 10 μL+cDNA模板2 μL+上下游引物各1 μL+RNase-fress水7 μL)按照程序扩增：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s，循环40次，最后72 ℃延伸5 min。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。基因甲基化状态包括完全甲基化和不完全甲基化。

1.5 美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评估

所有病人入院后24 h内采用NIHSS评估神经功能缺损程度。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组受试者一般资料比较

A组和脑梗死组病人年龄、性别、吸烟史、饮酒史、舒张压、TC水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；脑梗死组病人糖尿病史、高血压史、收缩压、TG水平、FPG水平、hcy水平与A组比较，差异有显著性(χ2=8.45、37.06，F=3.33～249.98，P<0.05)。见表1。

表1 各组受试者一般资料比较

2.2 受试者TM启动子区甲基化检出率比较

脑梗死组TM启动子区甲基化率与A组比较，差异具有显著性(χ2=13.071，P<0.05)。D组病人TM启动子区甲基化率明显高于B组病人，差异具有显著性(χ2=10.049，P<0.05)。D组病人NIHSS评分高于B、C组病人，差异具有显著意义(F=271.361，P<0.05)。Spearman相关性分析显示，脑梗死病人TM基因启动子区甲基化水平与病人入院24 h内NIHSS的评分呈正相关(r=0.537，P<0.05)。见表2。

表2两组受试者TM启动子区甲基化检出率及NIHSS评分比较(例(χ/%))

组别n完全甲基化不完全甲基化完全非甲基化NIHSS评分(x±s)脑梗死组9623(23.96)51(53.13)22(22.92)6.53±1.19A组382(5.26)15(39.47)21(55.26)1.17±0.94B组415(12.20)22(53.66)14(34.15)2.68±0.86C组348(23.53)20(58.82)6(17.65)5.79±1.02D组2110(47.62)9(42.86)2(9.52)8.42±0.99

2.3 脑梗死病人TM基因启动子区甲基化状态影响单因素分析

将脑梗死病人分别按照年龄、性别、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高血压史以及血清hcy浓度进行分组，结果显示，65岁以上、有饮酒史、血清hcy水平高的病人甲基化率明显高于65岁以下、无饮酒史以及hcy水平正常的病人，差异具有统计学意义(χ2=5.899～10.590，P<0.05)。见表3。

2.4 多因素Logistic回归分析脑梗死病人TM基因启动子区甲基化的危险因素

选择单因素分析中P<0.05的因素(如年龄(X1)、饮酒史(X2)、血清hcy水平(X3))作为自变量，并对各因素进行赋值，年龄<65岁赋值为0，年龄≥65岁赋值为1；无饮酒史赋值为0，有饮酒史赋值为1；血清hcy水平<15 μmol/L赋值为0，血清hcy水平≥15 μmol/L赋值为1；以0作为参考类别，以脑梗死病人TM基因启动子区甲基化状态为因变量，进行多因素Logistic回归分析，结果显示，病人年龄(OR=1.299，95%CI=1.075～6.678，P<0.05)、饮酒史(OR=6.654，95%CI=3.456～8.987，P<0.05)以及hcy水平升高(OR=5.098，95%CI=2.876～7.845，P<0.05)是影响病人发生TM基因甲基化的独立危险因素。见表4。

表3脑梗死病人TM基因启动子区甲基化状态影响单因素分析(例(χ/%))

指标n甲基化状态χ2P年龄(岁) ≥655146(90.20) <654528(62.22)10.5900.050性别 男5943(72.88) 女3731(83.78)1.5300.216吸烟史 有1412(85.71) 无8262(75.61)0.2350.628饮酒史 有2020(100.0) 无7654(71.05)5.8990.015糖尿病史 有109(90.00) 无8665(75.58)0.3920.531高血压史 有5344(83.02) 无4330(69.77)2.3600.125hcy水平(c/μmol·L-1) ≥158972(80.90) <1572(28.57)7.2390.007

表4多因素Logistic回归分析脑梗死病人TM基因启动子区甲基化的危险因素

影响因素偏回归系数标准误Waldsχ2值OR值95%CIP值年龄0.6790.3576.9631.2991.075～6.678 0.01饮酒史2.8450.74510.5676.6543.456～8.987<0.05hcy水平2.3340.6439.6325.0982.876～7.845<0.05

3 讨 论

脑梗死被认为是具有明显遗传倾向的复杂疾病，我国大部分脑梗死病人属于多基因型脑梗死，病人在环境和遗传因素的共同作用下，多个微效易感基因相互叠加，导致脑梗死发病[13]。筛选脑梗死高危人群对降低脑梗死的发生率具有重要的临床意义。本研究首先比较了脑梗死病人和健康人群一般资料和基线资料的差异，其中脑梗死病人合并高血压的比例以及FPG、TG和血清hcy水平均高于健康受试人群。

脑梗死的发病机制尚未明确。研究显示血液高凝状态和凝血-纤溶系统失衡是脑梗死重要的发病基础[14]。TM作为凝血酶受体家族成员之一[15]，一方面可与凝血酶特异性结合，直接抑制凝血酶的促凝血活性[16]；另一方面可以通过抑制凝血因子Ⅴa、Ⅷa、Ⅸa、Ⅴa等形成凝血复合物，从而激活蛋白C，导致血管内纤溶功能失常，发挥抗凝作用[17]。2006年，国内潘志勇等[18]学者提出血浆TM可作为反映血管内皮细胞损伤的敏感指标，对脑血管病的诊断、病情评估有重要的临床意义。2011年，武岭等[19]学者进一步提出TM基因多态性与脑梗死密切相关。近些年，随着基因组计划和后基因组计划研究工作的深入开展，为脑梗死发生发展的遗传学机制提供了新的研究思路和方法。通过对TM基因甲基化状态的研究，为从基因水平上认识脑梗死的发病机制以及筛选高危人群奠定了基础。上个世纪末，由VAN DER VELDEN等[20]首次发现TM配体结合域存在功能性氨基酸变异现象，但是并未发现与血栓形成具有相关性；随后，NORLUND等[21]学者又进一步发现TM基因多态性对脑梗死的发病有一定影响。但是目前关于TM基因启动子区域甲基化状态与脑梗死发生的相关性研究尚未见确切报道[22]。本项研究结果显示，梗死病人TM基因启动子区甲基化水平明显高于对照组人群，而且TM基因甲基化率越高，脑梗死病灶面积越大，且TM基因启动子区甲基化水平与神经功能缺损NIHSS评分呈正相关性。说明TM基因启动子区异常高甲基化与脑梗死的发生、梗死病灶面积以及神经功能缺损程度密切相关。

此外，通过多因素分析，本研究认为病人年龄、饮酒史和hcy水平是影响病人发生TM基因甲基化的独立因素。年龄是心脑血管疾病不可干预的独立危险因素，这与老年病人器官功能衰退有关，不仅TM基因甲基化程度随着年龄的增加而升高，其他很多易感基因也与年龄密切相关。另外，酒精可引起血脂代谢异常，造成血管内皮损伤效应[23]，虽然本项研究证实饮酒是脑梗死病人TM启动子区甲基化状态的危险因素，可能通过影响TM基因甲基化参与脑梗死的发生，但是具体的作用机制尚需进一步研究。hcy属于甲硫氨酸和半胱氨酸代谢中间产物，虽然不直接参与蛋白质的合成，但是是甲硫氨酸循环的重要参与分子[24]。甲硫氨酸循环属于再甲基化途径[25]，hcy通过该途径形成S腺苷甲硫氨酸，而S腺苷甲硫氨酸是DNA甲基化的目前已知唯一供体[26-30]，因此hcy可能对TM基因甲基化有一定的影响。本研究发现脑梗死病人血清hcy水平高于健康对照组，且随着脑梗死病人血清hcy水平升高，TM基因甲基化程度呈增加趋势，两者呈显著正相关。

综上所述，脑梗死病人TM基因甲基化程度明显高于健康受试人群，与脑梗死灶面积以及NIHSS评分呈正相关，而且年龄增加、常年有饮酒史和hcy水平升高是病人发生TM基因甲基化的独立危险因素，为脑梗死发病机制的研究提供了表观遗传学的证据。