Septin-9在ALL病儿骨髓组织中的表达及意义

(1 鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)血液内科，湖北 黄石 435000； 2 武汉市协和医院血液内科)

急性淋巴细胞白血病(ALL)作为一种儿童时期常见的血液系统恶性肿瘤，是由于骨髓中的原始幼稚细胞发生克隆性异常增殖并抑制正常造血功能导致的，严重威胁儿童生命健康[1-2]。目前，随着临床上ALL化疗技术的不断进展，多数病儿预后比较良好，但是仍有20%～30%的病儿化疗后会出现复发[3-5]，而复发病儿再次化疗缓解率较低，预后不佳[6]。因此，积极探讨影响ALL复发的相关机制对改善病儿预后具有重要意义。胞裂蛋白(Septin)作为一种进化上高度保守的具有GTPase活性的基因家族，广泛存在于真核生物体内，在细胞分裂、细胞周期调控、细胞内物质转运、细胞凋亡等多种生物学功能中发挥重要作用[7]。Septin-9是Septin家族的重要成员，有研究表明，Septin-9参与了多种恶性肿瘤恶性化过程，且与肿瘤复发密切相关[8]。本研究拟观察ALL病儿骨髓组织中Septin-9表达的变化，并分析Septin-9表达变化对ALL细胞增殖和侵袭力的影响，以探讨其在儿童ALL发病机制中的作用，并为临床上的靶向治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年2月—2017年8月在我院门诊就诊或住院治疗的ALL病儿共94例，其中初诊病儿63例，男37例，女26例，年龄1.4～14.2岁，平均(6.4±2.8)岁；包括急性B系淋巴细胞白血病(B-ALL)44例和急性T系淋巴细胞白血病(T-ALL)19例；根据中国儿童血液病研究组2008方案组(CCLG-08组)分组标准分为标危组17例，中危组22例，高危组24例。缓解病儿20例，男11例，女9例，年龄2.5～13.4岁，平均(7.7±3.6)岁。复发病儿11例，其中男7例，女4例，年龄1.8～14.5岁，平均(7.7±4.3)岁。另选取同时期进行骨骼矫治手术的病儿16例作为对照组，其中男9例，女7例，年龄2.7～12.8岁，平均(7.2±3.1)岁；均排除血液系统疾病及其他恶性肿瘤。各组病儿性别、年龄比较差异无显著性(P>0.05)。

1.2 主要试剂和设备

淋巴细胞分离液购自中科院生物医学工程研究所；人Jurkat细胞系购自上海中乔新舟生物科技公司；RPMI 1640培养基、体积分数为0.10胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；Trizol总RNA提取试剂盒和Lipofectamine 2000转染液购自美国Invitrogen公司；逆转录和PCR扩增试剂盒购自美国Applied Biosystems公司；Septin-9和内参序列由上海生工生物工程有限公司设计合成；Septin-9干扰序列和阴性对照序列由上海吉玛制药技术公司设计合成；兔抗人Septin-9多克隆抗体购买自美国Santa Cruz公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)液和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；细胞周期检测试剂盒购买于南京凯基生物科技发展公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购买于美国BD公司，实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶电泳分析系统购买于日本Kodark公司。

1.3 方法

1.3.1标本采集 所有研究对象均抽取新鲜骨髓样品2～5 mL，肝素抗凝，加入淋巴细胞分离液；用离心机2 000 r/min离心25 min，留取界面层单个核细胞，PBS冲洗2次，计数并分装于无菌离心管内，于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.3.2实时荧光定量PCR技术检测单个核细胞中Septin-9 mRNA表达 按照Trizol总RNA提取试剂盒说明完成操作，提取单个核细胞中总RNA，利用BIO分光光度计对总RNA纯度和浓度进行检测，以A260/A280在1.80～2.20且浓度≥200 mg/L为合格。按逆转录试剂盒说明将总RNA逆转录为单链cDNA，以cDNA为模板，按照PCR试剂盒进行荧光定量PCR扩增。引物序列如下。Septin-9上游引物：5′-CCAAGTGACCAGGGAAGTGT-3′，下游引物：5′-AAGGCACGGGTAGATCAACAG-3′，GAPDH上游引物：5′-AGCCACATCGCTCAG-ACAC-3′，下游引物：5′-GCCCAATACGACCAAA-TCC-3′。PCR反应条件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，75 ℃ 30 s，循环38次，每个样品设3个平行复孔。用2-△△Ct法计算单个核细胞中Septin-9 mRNA的相对表达量。

1.3.3细胞培养和处理 将Jurkat细胞用含体积分数为0.01胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，于37 ℃、饱和湿度、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养。24 h后胰酶消化，传代培养。取对数生长期的细胞，接种于24孔板中，细胞浓度2×108个/L。用Lipofectamine 2 000转染液对细胞进行分组转染：①Septin-9干扰组(C组)：转染Septin-9小分子RNA干扰序列，正义链：5′-AGGCGUACCGUG-UGAAGCGCCUCAA-3′，反义链：5′-UUGAGGC-GCUUCACACGGUACGCCU-3′；②阴性对照组(B组)：转染阴性对照序列，正义链：5′-TTTGCGCTC-TTCGGATCTTTAGCTCTTGATATCCGGAGCT-AAAGATCCGAAGAGTTTTTT-3′，反义链：5′-C-TAGAAAAAACTCTTCGGATCTTTAGCTCCG-GATATCAAGAGCTAAAGATCCGAAGAGCG-3′；③空白组(A组)：不作任何处理。各组细胞转染完成后恒温培养48 h，完成后续实验。

1.3.4Western blot方法检测各组细胞中Septin-9蛋白表达 取转染后培养48 h细胞，用细胞裂解液裂解，用总蛋白提取试剂盒提取细胞中总蛋白，用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度检测试剂盒对蛋白进行定量检测。行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，将膜在含有50 g/L脱脂奶粉的PBS中封闭60 min。加入一抗(稀释比例1∶800)，4 ℃孵育过夜；洗膜3次，加入二抗，室温孵育120 min；洗膜3次，暗室下用化学发光试剂显影、定影。以GAPDH为内参照，采用Image J图像分析软件进行分析，以获得目的蛋白条带相对表达量。

1.3.5MTT法检测细胞增殖能力 取各组细胞，胰酶消化，制备单细胞悬液，密度为5×109个/L。取200 μL单细胞悬液接种于96孔板中，每组设6个复孔，恒温培养，于37 ℃、饱和湿度、含体积分数0.05的 CO2培养箱中培养。分别于培养24、48、72、96 h时，向各孔加入MTT液(5 g/L)20 μL，继续培养4 h，弃培养液，各孔加入DMSO液150 μL，充分振荡15 min，采用酶标仪于490 nm波长处检测各孔吸光度A值。

1.3.6流式细胞术检测各组细胞周期 取各组转染后培养48 h细胞，预冷PBS冲洗3次，室温下1 000 r/min离心6 min；弃上清液，4 ℃下用冰乙醇过夜固定；室温下1 000 r/min离心6 min，弃乙醇，PBS冲洗2次。根据试剂盒说明操作，加入RNase A，室温下静置1 h，后以1 000 r/min离心6 min；弃上清液，加入碘化丙啶(PI)500 μL，避光反应0.5 h；上机检测2×104个细胞，用CellQuest软件对细胞周期进行分析。

1.3.7划痕实验检测细胞迁移能力 取各组细胞，胰酶消化，离心留取细胞沉淀，按5×104/孔细胞接种于6孔板。待细胞铺满皿底后，用移液枪枪头垂直于孔板尽量画直线，用PBS冲洗3次，加入不含血清的培养液，恒温培养，于37 ℃、饱和湿度、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养。分别于0、24和48 h时拍照，计算划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h/48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。重复实验3次。

1.3.8Transwell小室检测细胞侵袭能力 将Matrigel基质胶稀释后平铺于Transwell上室，4 ℃风干备用。取各组细胞，胰酶消化，离心留取细胞沉淀，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×109个/L。取200 μL细胞悬液加入小室上室，将500 μL含体积分数为0.10胎牛血清的培养液加入小室下室，置于37 ℃、饱和湿度、含体积分数0.05的CO2培养箱中进行培养。24 h后，将小室取出，以40 g/L的甲醛固定，结晶紫染色，PBS冲洗3次，用棉签轻轻将散落的细胞去除，显微镜下观察并计算穿膜细胞数。实验重复3次。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 初诊病儿骨髓单个核细胞中Septin-9表达

初诊病儿骨髓单个核细胞中Septin-9 mRNA的相对表达量为1.77±0.33，高于对照组的1.15±0.11，差异有统计学意义(t=7.283，P<0.05)；初诊病儿中，B-ALL和T-ALL病儿骨髓单个核细胞中Septin-9 mRNA相对表达量分别为1.74±0.34和1.82±0.29，差异无显著统计学意义(t=0.812，P>0.05)。标危组、中危组和高危组病儿骨髓单个核细胞中Septin-9 mRNA的相对表达量分别为1.42±0.17、1.72±0.14和2.05±0.21，组间比较差异均有统计学意义(F=108.770，P<0.05)。

2.2 不同病程病儿骨髓单个核细胞中Septin-9的表达

初诊病儿、缓解病儿和复发病儿骨髓单个核细胞中Septin-9 mRNA的相对表达量分别为1.77±0.33、1.37±0.07和2.26±0.16，各组间比较差异均有统计学意义(F=51.456，P<0.05)。

2.3 各组细胞中Septin-9蛋白表达

C、B和A组细胞中Septin-9蛋白相对表达量分别为0.31±0.06、0.75±0.11和0.86±0.10，差异有统计学意义(F=62.232，P<0.05)；B组和A组细胞中Septin-9蛋白相对表达量比较差异无显著性(t=1.846，P>0.05)；C组细胞中Septin-9蛋白的相对表达量低于B、A组，差异具有统计学意义(t=8.719、12.159，P<0.05)。见图1。

A：A组；B：B组；C：C组。

2.4 各组细胞增殖能力比较

C、B和A组24、48、72和96 h细胞增殖能力比较，差异具有统计学意义(F=7.349～32.761，P<0.05)；B组和A组24、48、72和96 h细胞增殖能力比较，差异无统计学意义(P>0.05)，C组24、48、72和96 h细胞增殖能力低于B、A组，差异有统计学意义(t=2.842～48.371，P<0.05)。见表1。

2.5 各组细胞周期的变化

C、B和A组G0/G1期和S期细胞比例比较差异均具有显著性(F=7.887、8.148，P<0.05)；B组和A组G0/G1期和S期细胞比例比较差异无显著性(t=0.365、0.874，P>0.05)；C组G0/G1期细胞比例高于B组和A组，而S期细胞比例低于B组和A组，差异具有显著统计学意义(t=3.112～4.157，P<0.05)；C、B和A组G2/M期细胞比例比较差异无显著性(F=0.785，P>0.05)。见表2、图2。

表1 各组细胞增殖能力比较

表2 各组细胞周期变化

2.6 各组细胞迁移和侵袭能力

划痕实验结果显示，C、B和A组24和48 h划痕愈合率比较差异具有显著性(F=42.444、97.442，P<0.05)。B组和A组24和48 h划痕愈合率比较差异无显著性(t=0.583、0.972，P>0.05)，C组24和48 h划痕愈合率低于B、A组，差异具有显著意义(t=7.299～13.964，P<0.05)。结果见表3和图3。Transwell实验结果显示，C、B和A组侵袭细胞数比较差异有显著性(F=66.073，P<0.05)；B组和A组侵袭细胞数比较差异无显著性(t=1.287，P>0.05)；C组侵袭细胞数低于B、A组，差异具有显著性(t=11.062、9.496，P<0.05)。见表3和图4。

表3 各组细胞迁移和侵袭能力比较

3 讨 论

白血病是导致儿童期病儿死亡的常见的恶性肿瘤之一，其中以ALL最为常见，约占白血病类型的75%以上[9-10]。目前，随着化疗方案的不断优化，儿童ALL总体5年无事件生存率约为90%[11-12]；但仍有部分病儿最终出现复发，而复发病儿再次缓解失败风险高、生存时间缩短，预后极差[13-16]。因此，发现和确定儿童ALL发生、进展及复发相关的高危mRNA，对指导治疗及提供治疗靶点具有重要意义。Septin-9 mRNA位于人染色体17q25.3，在细胞质分裂、细胞极化、细胞膜重构等多种生物学过程中发挥重要作用[17-18]；Septin-9是潜在的原癌基因，其异常表达可引起细胞极性丢失、形态改变，增加了细胞癌变风险[19-21]；且与肿瘤细胞异常增殖及凋亡密切相关[22-23]。现有研究表明，Septin-9在乳腺癌、人肾细胞癌及肝癌等多种恶性肿瘤组织中表达异常[21，24-26]。本研究结果显示，初诊病儿骨髓单个核细胞中Septin-9 mRNA相对表达量高于对照组，说明Septin-9 mRNA在ALL病儿骨髓单个核细胞中表达异常增加，可能参与了ALL发病；同时，随着临床危险度分级升高，Septin-9 mRNA相对表达量逐渐升高，提示Septin-9 mRNA表达与危险度分级有关，可作为评估ALL病儿危险度分级的指标。本研究结果还显示，复发病儿骨髓单个核细胞中Septin-9 mRNA相对表达量高于初诊和缓解病儿，且初诊病儿高于缓解病儿。说明Septin-9在ALL病儿骨髓单个核细胞中表达与病儿治疗效果有关。

为进一步观察Septin-9对ALL细胞生物学功能的影响，本研究利用小分子RNA干扰技术特异性抑制人Jurkat细胞中Septin-9 mRNA表达。结果显示，C组细胞中Septin-9蛋白相对表达量低于B、A组，提示C组细胞中Septin-9 mRNA表达被成功抑制。本研究结果显示，C组24、48、72和96 h细胞增殖能力低于B、A组，表明特异性抑制了人Jurkat细胞中Septin-9 mRNA表达，可有效抑制细胞增殖，提示Septin-9可能参与了细胞增殖过程[27]。

A：A组；B：B组；C：C组。

图2各组细胞周期的变化

A：A组；B：B组；C：C组。

A：A组；B：B组；C：C组，结晶紫染色，200倍。

细胞周期检测结果显示，C组G0/G1期细胞比例高于B、A组，而S期细胞比例低于B、A组，表明抑制Septin-9 mRNA表达可抑制细胞周期由G0/G1期转化为S期，提示Septin-9可能通过改变细胞周期而参与调节细胞增殖[28-29]。本研究结果显示，C组24 和48 h划痕愈合率、侵袭细胞数均低于B、A组，表明抑制Septin-9 mRNA表达可有效抑制细胞迁移和侵袭能力[30]，提示Septin-9可能参与了人Jurkat细胞迁移和侵袭过程。

综上所述，Septin-9在ALL病儿骨髓单个核细胞中呈高表达，且与临床危险度分级和复发有关，特异性抑制人Jurkat细胞中Septin-9 mRNA表达，可能通过改变细胞周期而抑制细胞增殖；同时，可抑制细胞迁移和侵袭能力，有望为ALL发病机制研究及mRNA靶向治疗提供新的靶点。