木质素基因调控对木材细胞壁化学组分与微观结构影响的研究进展

刘苍伟，苏明垒，王玉荣，赵荣军

(中国林业科学研究院 木材工业研究所，北京 100091)

木质纤维材料是重要的生物质能源和制浆造纸原料。随着化石能源物质枯竭以及社会经济发展对木质纤维材料的需求日益增加，定向培育优质速生人工林成为保障木质纤维材料供应的重要途径之一。木质纤维材料主要来源于木材细胞壁，由纤维素、半纤维素和木质素3种高分子聚合物组成[1-3]。其中纤维素是构成细胞壁的基本骨架，木质素与半纤维素作为基质，沉积在纤维素框架内[4]。纤维素和半纤维素是木质纤维材料作为生物质能源和制浆造纸原料的主要利用成分，其相对含量高低和提取工艺的难易，是评价木质纤维材料优劣的主要指标[2,5]，但木质素的存在影响了木质纤维材料可发酵糖的提取，降低了纸张质量，阻碍了木质纤维材料的利用。因此，在分子水平上调控木材细胞壁木质素的含量和结构，提高木质纤维材料品质，已成为国内外学者的研究热点[2,5-7]。

通过调控木质素生物合成基因使木质素合成途径受阻，降低木质素含量或改变其结构从而提高纤维素分解和糖转化效率，对于木质纤维材料利用具有重大意义[2,7]。但从遗传学与生物学角度来讲，植物都有自我调节机制，改良植物体的单个目标性状，会对其他性状产生影响，如改变细胞壁木质素的含量，会引起纤维素代偿性增加[8]。目前人们也认识到，含有木质素、纤维素和半纤维素等化学组分的细胞壁，不仅是一个机械支持和保护原生质体的结构，而且是一个能进行代谢活动的结构，它参与着细胞的生长、分化、识别、抗病等过程[9-10]。因此细胞壁各组分的合成、组装与沉积及其理化性质决定着细胞壁相应的功能[11]。因此本文主要论述木质素调控基因活性改变对转基因木材细胞壁化学组分及其微观结构的影响，并对近年的研究前景进行展望，旨在为转基因木材木质素含量降低后纤维素分解与糖转化性能的改变机制，以及细胞壁的综合利用提供科学依据，对优质速生人工林的选育和培育提供理论指导。

1 木质素合成途径及基因调控过程

目前广泛认同，木质素生物合成过程由苯丙氨酸起始，经过一系列羟基化、甲基化、连接和还原反应生成木质素单体，然后转运到木质化沉积位点，最终这些结构单元在细胞壁中羟化聚合成木质素。具体而言，木质素的合成途径包含3步，即莽草酸途径、苯丙烷途径和特异合成途径。莽草酸途径是将植物光合作用的同化产物合成芳香氨基苯氨酸、酪氨酸和色氨酸等；苯丙烷途径是将苯丙氨酸转化为羟基肉桂酸及其辅酶A酯类；特异合成途径是指完成木质素单体的合成，即将羟基肉桂酰辅酶A酯类进一步合成为木质素结构单元及其大分子聚合物[12-13]。

木质素合成途径的揭示为后期木质素基因工程的发展奠定了坚实的基础，且在其苯丙烷途径和特异合成途径上关键酶的调控基因也已被成功克隆。苯丙烷途径主要包含苯丙氨酸氨解酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸4-羟基裂解酶(cinnamic acid 4-hydroxylase,C4H)和4-肉桂酸CoA连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)3类酶。它们位于木质素合成途径上游，决定着植物体内碳元素的流向，其活性将直接影响植物体内木质素的含量，因此通过调控这些关键酶基因的表达能够成功调控目标植物中木质素的含量。特异合成途径上的肉桂酰CoA还原酶(cinnamoy1 CoA reductase,CCR)和肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)属于还原调控酶，主要调控木质素单体的合成。学者一般认为，这2种酶对木质素总含量的影响是通过改变木质素单体的含量来实现的。此外对C3和C5位置上发生的羟基化和甲基化反应起催化作用的香豆酸3-羟化酶(coumarate acid 3-hydroxylase,C3H)、咖啡酸/5-羟基阿魏酰-O-甲基转移酶(bispecific cafeic acid/5-hydroxyferulic acid O-methyltransferase,COMT)、阿魏酸5-脱氢酶(ferulic acid 5-hydroxylase,F5H)以及咖啡酰CoA-O-甲基转移酶(caffeoyl-CoA O-methytransferase,CCoAOMT)等活性的改变，同样对林木体内的木质素含量有重要的调控作用[14-16]。

2 基因调控对细胞壁组分含量及其结构变化的影响

2.1 基因调控对木质素含量的影响

2.1.1 不同合成途径的影响 PAL是苯丙烷途径上的第1个调控酶，抑制其表达活性能明显降低木质素含量，且伴随植物生长特性异常变化。C4H与PAL类似，不属于木质素单体合成的直接调控酶，主要调控非木质素酚类物质的合成[17]，其活性降低时木质素含量明显降低。Bjurhager等[18]通过抑制杨树(Populus)中C4H的活性，发现Klason木质素含量下降了30%。4CL属于连接反应酶，以肉桂酸为底物催化生成相应的CoA酯，抑制了杨树中4CL活性后，Klason木质素含量同样下降了40%～45%[19-22]。

C3H属于细胞色素P450酶，调控单体碳源流向，抑制杨树中C3H活性后，Klsaon木质素含量下降幅度可达56%，而且通过组织化学染色和木质素对紫外光荧光特性的定性观察，发现转基因杨树木质素含量同样存在明显差异[23-24]。在COMT与CCoAOMT基因表达被抑制的转基因林木植物中，木质素含量变化不明显；而在烟草(Nicotiana)中抑制其表达时，木质素含量显著降低[5,25-26]。Wang等[27]研究了调控糖基转移酶对转基因杨树的影响发现，PtGT1基因超表达后Klason木质素含量明显增加，Wiesner和Mäule染色程度也强于对照组。

在杨树中抑制CCR基因的表达，木质素含量下降可达50%[28]；而转CCR桉树(Eucalyptus)中木质素含量只下降了8%[29]，这可能与木材种类以及基因活性下调量有关。在杨树、烟草和苜蓿(Meguminosae)中抑制CAD活性对木质素总体含量并无明显影响，但茎秆间苯三酚染色有明显不同[5,30-32]。

2.1.2 不同调控方式的影响 采用不同调控方式对转基因木材木质素含量的影响也具有差异性。Tian等[33]通过正义、反义和RNAi 3种方式调控转基因杨树中4CL活性，发现正义调控4CL活性后木质素含量升高18.52%，而反义调控后降低28.52%，RNAi调控也使木质素含量有所下降，并且木质素含量的变化与4CL活性呈正相关，说明4CL基因能够成功调控木质素合成。用不同方式抑制杨树中COMT活性后发现，采用正义RNA抑制COMT活性能够降低转基因杨树中木质素的含量，而其他调控方式对木质素总含量无明显影响[5]。调控CCoAOMT基因过表达能够增加木质素的含量；而利用反义RNA技术调控CCoAOMT基因，能够有效降低杨木中Klason木质素的含量，提高杨木的造纸性能[13]。

2.2 基因调控对木质素组分结构变化的影响

2.2.1 木质素组分结构种类 木质素主要由甲基化聚合程度不同的单体聚合成的紫丁香基丙烷(S)、愈创木基丙烷(G)、对羟苯基丙烷(H)3种结构单元组成，在不同植物体内含量和成分不同。如针叶树主要为愈创木基结构单元，其他结构单元含量较少；阔叶树和草本植物以紫丁香基结构单元和愈创木基结构单元为主，含少量对羟苯基结构单元[5,12,34-35]。各结构单元间主要通过C—C键和C—O键联接。研究发现，与G单元木质素相比，无C5位置S单元的C—C键更易除去，因此当S单元相对含量增加或S/G升高时，木质素易于分解，从而有助于木质纤维材料的利用[36]。

2.2.2 不同调控途径的影响 学者还研究了转基因木材木质素结构的变化，发现改变某些木质素合成酶基因表达时也能改变其组成结构，如位于苯丙烷途径上的第1个限速酶PAL，抑制其活性能够明显降低木质素含量,同时使木质素结构发生变化[5]，而调控C4H、4CL等酶活性能明显降低木质素总含量，但对杨树中木质素的结构无明显影响[18,22]。

位于特异合成途径上游的C3H、COMT、CCoAOMT和F5H等酶对木质素单体的合成有重要调控作用。C3H被认为是调控S和G单元合成的关键酶，抑制其在杨树中的活性后，木质素总含量下降，但H单元相对含量增加，S单元含量不变，而G单元含量下降，致使S/G增大[23,36]。学者通过组织化学染色差异进一步验证了S、G单体含量和微区分布上的差异[37]。抑制COMT基因表达对木质素总含量无明显影响，但能明显改变木质素结构，表现为S单元含量下降，G单元含量增加，使S/G降低[25,38]。CCoAOMT酶对S单元和G单元合成有调控作用，反义调控杨树中CCoAOMT活性后发现，由于G单元下降幅度相对较大从而使S/G升高，使杨木更适宜制浆造纸[39]。 F5H则被认为是调控S单元木质素合成的关键调控酶，其活性与S单元木质素含量呈正相关。在杨树中超表达F5H基因后，木质素总量下降而S单元含量增加[40]，木质素支链减少更有利于分解[41]。相反，抑制F5H基因表达后，S单元木质素含量明显下降，进一步证明F5H能够调控S单元木质素的合成[42]。

调控特异合成途径上的CCR和CAD活性，同样能影响木质素单体的合成。CCR主要调控S单元木质素的合成，在杨树中抑制其活性能够明显降低S单元木质素含量[28]。CAD则对S和G单体的合成有影响，Baucher等[43]通过反义抑制转基因苜蓿中的CAD，发现木质素总量未发生变化，但是S基单体含量降低，S/G降低。但在转基因杨树中，通过反义抑制CAD活性发现，木质素总量和结构、组分都未发生明显变化，而木质素中的醛类物质含量有所增加[30]，表明CAD在不同植物体内的调控方式可能存在差异。

2.2.3 多基因调控的影响 研究人员发现，S和G单元木质素的调控是相对独立的，利用特定基因调控能够实现针对性调控S/G[5]。因此，许多学者采用双基因平行调控S和G单元木质素含量，来升高S/G，从而优化木质纤维材料的利用。如Franke等[40]通过C4H-F5H双基因调控杨树和烟草中的木质素含量发现，烟草中G单元木质素含量明显降低，S单元木质素含量明显升高，S/G升高；杨树中G单元和S单元木质素含量均明显降低，其中G单元木质素含量降幅更大，最终导致S/G升高。通过多基因调控在降低木质素含量的同时，对木质素组分结构进行调控，例如在杨树中抑制4CL表达的同时增加CALD5H活性后发现，木质素含量下降52%，S单元木质素含量增加，使S/G上升64%，有利于木质纤维材料的利用[44]。

2.3 基因调控对细胞壁其他化学组分的影响

2.3.1 对细胞壁其他化学组分含量的影响 木材细胞壁重要组分中除了木质素外，还有纤维素和半纤维素。研究表明，部分转基因植物中木质素含量降低时，纤维素和半纤维素等物质含量会代偿性增加，这有助于提高木质纤维材料的利用率。如Bjurhager等[18]发现，木质素含量降低的同时纤维素和半纤维素含量增加。Jouanin等[25]通过抑制COMT活性来调控杨木木质素的合成，发现木质素总量降低17%，但C5位置木质素相对含量增加；纤维素含量升高，有利于杨树在造纸工业中的利用；但C5位置木质素易与其他单体结合为较稳定C—C键而不利于木质素去除，因此虽然转COMT基因杨树C5位置木质素含量增加，但并未提高可发酵糖产量。人们在柳枝稷(Panicum)中却发现，COMT活性下降后生物酒精产量增加，糖转化率提高[45]，进一步说明抑制不同植物相同基因表达后对植物化学成分的影响不同。Doorsselaere等[46]在转基因杨树中发现，COMT活性下降后纤维素含量增加。在杨树中抑制CCR活性后半纤维素含量降低而纤维素含量增加，且5年内基因下调性状稳定[5]。

木材细胞壁层含有多种化学成分共同维持植物机体正常新陈代谢，当合成木质素调控基因表达发生变化时，为了维持植物机体正常的生长发育，其他微量化学成分也会发生相应的变化，以保证植物体正常的生理代谢。Ziebell等[47]发现，在C3H和C4H活性下调的桉树中，NaOH抽提物含量明显升高，表明木质素等主要化学成分缺失时微量化学组成成分会补偿性增加，保证了植物机体的生长发育。在CAD基因抑制调控的4年生杨树中发现，蛋白质含量也有所降低[5]。对转4CL基因杨树的研究发现，木质素合成途径受阻后，植物体内的生长素含量明显升高，以维持植物体的正常生理代谢[33]，抽提物含量升高2倍[20-21,48]。在杂交杨中抑制C3H活性后，木质素含量降低，淀粉含量增加，促进了黄酮类化合物的合成，导致叶片花青素积累[23]。在RNAi转C3H基因玉米植物中同样发现，类黄酮和花青素等微量化学成分含量有一定的变化[49]。

2.3.2 对细胞壁其他组分结构的影响 研究表明，基因调控不但对细胞壁木质素的结构变化起作用，对半纤维素的组成结构也有一定影响。Coleman等[23]发现，抑制杂交杨的C3H调控基因表达，木质素含量降低，葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等单糖组分含量也发生一定变化，表明C3H活性下调会引起植物化学成分的代偿性变化。Min等[50]发现，抑制4CL基因的表达，木质素含量大幅度降低，葡聚糖含量明显高于野生型，木聚糖和其他小分子糖含量也略有增加。除此之外，基因调控对半纤维素的分子量也有一定影响，彭霄鹏[24]在研究转C3H基因杨树中发现，转基因杨树的半纤维素分子量比野生型高，且转基因杨树的DMSO和碱性半纤维素分散系数更均一。Leplé 等[28]发现，通过下调CCR活性可以降低木质素的含量，提高纤维素的含量，与此同时半纤维素含量降低且结构组分发生了变化，其中葡萄糖、木糖、鼠李糖、甘露糖的含量均明显降低，证明基因调控木质素含量变化的同时，会引起其他成分的代偿性变化。此外，研究人员还发现，在杨树和拟南芥(Arabidopsis)中调控RabG3bCA、UDP和2-PE等其他非木质素合成调控基因，对半纤维结构也有一定的影响，且引起葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和木聚糖等单糖含量的变化，对细胞壁纤维素成分的糖转化性能也有一定影响[51-53]。

3 基因调控对木材组织细胞微观结构的影响

3.1 对木材显微结构的影响

木质素是木材细胞壁的基质成分之一，对维持细胞形态及提供力学支撑有重要作用[35]。对转基因林木的研究发现，基因调控在改变细胞壁木质素含量及结构的同时，对其组织细胞显微结构也有一定影响。如随着木质素含量下降，转C3H基因杨树中韧皮纤维细胞数减少，导管尺寸变小但数目增多，木质部细胞层数增多[23-24,54]；抑制杨树中CCR的活性，同样发现纤维细胞壁呈现出连续的同心层或组织细胞排列杂乱无章[28]。导管尺寸和数目的变化，可能与转基因林木体内水分运输有关，木质素的疏水性是保证水分及营养物质在植物体内运输的重要性能，木质素含量及结构发生变化时必将对植物体内的水分运输产生影响，在转IAA合成调控基因和转4CL杨树中发现，木质部导管尺寸下降而数目增多[55-56]；Schume等[57]研究了地下水分对杂交杨木显微结构的影响，发现低水分运输可引起导管尺寸降低和数目的增加。在转C3H基因杨树中发现，根系侧根数目增加可保证植物体内的水分运输[24]，进一步说明基因调控影响了转基因木材的显微结构，也说明杨树能够在一定程度上进行自我调控以保证其正常生长发育。

前人研究结果表明，基因活性调控对烟草、拟南芥、玉米(Zea)和苜蓿等草本转基因植物显微结构也有重要影响，但不同基因对不同植物的影响有差异。如抑制C3H调控基因的表达，可导致玉米植株茎秆上维管束的尺寸降低[58]；在拟南芥中，C3H调控基因的表达量则与茎秆次生壁壁厚成正比关系[59]。苜蓿中莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase，HCT)调控基因沉默导致维管束结构受损，且细胞抗性降低[60]。抑制亚麻(Linum)CCoAOMT调控基因表达，导致木质部结构发生变化，细胞壁变薄，出现不规则的木质部显性表达[61]。转CAD调控基因烟草中茎干细胞壁变薄，韧皮部和木质部纤维增长，导管分子密度降低，次生木质部减少[62]。抑制拟南芥和烟草中CCR活性后，纤维和导管结构松散，微纤丝排列杂乱和细胞壁变薄[63-64]。

3.2 对木材细胞壁层超微结构的影响

作为木材细胞壁层的重要组成成分，木质素含量或结构变化对组织细胞壁层的形成均有一定影响，但由于不同基因调控对木质素等主要化学成分影响的差异性，因此对细胞壁超微结构的影响也不同。Bjurhager等[18]对转C4H基因杨树的研究发现，木质素含量降低对微纤丝的结晶度无明显影响，但微纤丝排列较对照组稀松。在转4CL基因杨树中，木质素含量下降45%，组织细胞壁层结构与对照组相似[22]，表明不同调控基因在转基因林木植株中表现有所差异。木质素含量明显下降的转CCR基因杨树与对照组杨树相比，组织细胞壁层排列不整齐,且次生壁各壁层区分不明显；对照组在S2层内侧有大量S单元木质素沉积，而外侧较少，表明木质素合成主要发生在次生壁S2层形成时；同时转基因杨木S单元在各壁层微区分布含量明显较稀疏且分布均匀；在细胞壁层原位揭示了木质素含量变化对组织细胞的影响[28]。

研究发现，木质素含量和结构变化对其组织细胞壁层结构有重要影响。Chabannes等[65]系统研究了CCR、CAD或CCR×CAD调控基因抑制表达的转基因烟草中，木质素单体在细胞壁层的沉积规律及以上基因对细胞壁层超微观结构的影响，发现CAD和CCR×CAD调控基因抑制表达对木质部组织细胞壁层结构影响不明显，而CCR活性下调后对纤维次生壁S2层排列有明显影响，但对S1层无影响；说明木质素的合成主要发生于次生壁加厚的过程中，改变木质素含量或结构主要对次生壁合成时具有重要影响作用；此外还发现，G、S单元木质素在组织细胞各壁层的沉积规律也发生了相应的变化。Fornalé等[49]发现，CAD活性下调后的转基因玉米壁层结构未产生明显变化，导管细胞壁中S单元木质素含量增多，纤维细胞壁的S单元含量减少、G单元含量增加，表明基因调控对木质素微区分布含量变化有重要调控作用，而其对组织细胞壁层结构的影响可能与其下调量或其他化学成分含量变化有关。

4 展 望

综上所述，木质素基因活性的改变能够有效调控木材细胞壁木质素含量和结构，对木材细胞壁其他化学成分也有一定影响，同时木质素基因活性改变后木材及其他转基因植物的显微结构也存在差异。但由于不同植物间具有生物差异性且基因调控作用不同，导致基因调控对植物体的影响具有多样性，此外基因调控方式对基因调控结果也有一定影响，因此研究转基因木材时要针对特定目标林木和基因及调控方式进行分析。结合前人对转基因木材的研究现状和趋势，发现有以下几个方面亟待研究：(1)阐明木质素调控基因对木质素、纤维素等多种化学成分微区含量分布变化的影响机制；(2)阐明木质素调控基因活性改变对纤维素及半纤维结构的变化规律，揭示其对纤维素分解及糖转化性能提升的影响机制；(3)系统揭示木质素基因表达下调量与木材显微结构和细胞壁层超微结构的响应机制，以便选育优质转基因木材资源；(4)从纵向不同发育角度系统揭示转基因木材细胞壁化学组分及解剖结构的生长发育规律。

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