甜瓜果长基因fl与性别表达基因a的遗传分析及定位

范文林，王贤磊，李群，俞志杰，李冠

(新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046)

0 引 言

【研究意义】2015年中国甜瓜种质面积691.35万亩，产量1 527.10万吨，占世界甜瓜的35.66%和48.6%《中国农业统计资料(2015)》。在过去的20年中，我国甜瓜产量增加了29%，种植面积增加了8%[1]。现代市场对甜瓜的需求趋向多元化，尤其是果实形状时常影响着人们的消费趋向[2]。果实形状在甜瓜中是一个有价值的性状，在甜瓜中开展对果实形状开展遗传与定位研究十分必要。目前甜瓜中大多数育种材料为雄花两性花同株，使甜瓜杂交育种工作中因人工去雄而费工费时，增加了杂交种成本，还常因去雄不完全，导致种子纯度降低，使优良杂交种推广受到影响[3]。要解决这些问题，需要在生产中培育出雌雄异花同株的甜瓜母本。通过分子手段对甜瓜雌雄异花同株基因进行定位，是实现快速、高效培育雌雄异花同株甜瓜母本的基础。【前人研究进展】在植物界，果实是最晚进化出的器官之一[4]。一些果实类植物(如番茄、西葫芦等)的果实形状和果实大小存在很大的差异[4]。比如在甜瓜(CucumismeloL.)中，C.meloVar. agrestis中果实一般4 cm长，而C.meloVar. Flexuosus中的果实一般2 m长[5]。先前的研究已经发现果实发育是受严格的遗传控制[6,7]。Sinnot研究发现西葫芦的果形遗传受双基因控制[8]。而大多数植物的果形遗传是受多基因控制的，比如黄瓜(Cucumissativus)[9]、甜瓜(C.melo)[10,11,12]、番茄(Lycopersicon)[13,14]和辣椒(Capsicum)[15,16]。2004年，Monforte等证明了甜瓜果实形状受严格的多基因遗传控制[17]。2007年，Eduardo等发现甜瓜果形的“基因与环境互作效应”是很低的，遗传力很高[18]。甜瓜的性别表达主要受三对基因(a，g和gy)的控制[19-23]。其中，A_G_基因型是雌雄异花同株；aaG_基因型是雄花两性花同株；A_gg 基因型是雌花两性花同株；A_gggygy 基因型是全雌花；aagg基因型是雌雄同花[3]。2002年，Perin等[4]发现控制甜瓜雌雄异花同株、雄花两性花同株的性别表达基因a只位于2号连锁群。2010年，刘威等[24]发现控制甜瓜雌雄异花同株、雄花两性花同株的性别表达基因a只位于4号连锁群。半个多世纪以前，国内外学者就开始了对甜瓜果实形状和性别表达类型(雄花两性花同株、雌雄异花同株)进行遗传定位的探索。1967年，Wall[21]通过对甜瓜muskmelon性别表达类型(雄花两性花同株、雌雄异花同株)及果实形状的统计及分析，发现性别表达类型受一个单基因控制，等位基因A负责雌雄异花同株的表达，而等位基因a负责雄花两性花同株的表达；他还发现甜瓜性别表达基因a与果形基因紧密连锁，雌雄异花同株植株的果实一般较长，而雄花两性花同株植株的果实偏圆。2002年，Perin等[4]利用两种长形甜瓜品种PI 161375和PI 414723分别与同一种圆形甜瓜品种vedrantais杂交获得的两种RIL群体对果实形状进行QTL分析，再次证明了甜瓜果实长度的一个主效QTL与性别表达基因a在2号连锁群紧密连锁。2005年，Monforte等[25]利用甜瓜Piel de Sapo和12种引进品种作为实验材料研究甜瓜果实相关性状的遗传模式也发现：通常甜瓜的单性花品种的果实一般比双性花品种的果实要长。2011年，王贤磊等[26]以甜瓜日本安农二号和新疆哈密瓜K413为材料对甜瓜果形性状进行遗传定位，发现C2连锁群上存在FS2.1和FS2.2两个控制甜瓜果形的QTLs，并且认为该连锁群上普遍存在控制甜瓜果形的QTLs。2017年，矫士琦等[2]以美国厚皮甜瓜品系ms-5和中国薄皮甜瓜品系HM-1为材料对甜瓜果实和种子相关性状进行QTL分析，在2号连锁群也发现了一个控制果实长度的QTL。各种甜瓜品种中2号连锁群上都普遍存在一个控制甜瓜果实长度的QTL。【本研究切入点】目前国内外关于甜瓜果形的研究都还处在相关QTL定位阶段，还未见有关克隆出甜瓜果形基因的报道。另外，目前对于甜瓜2号连锁群花性型基因a与果长基因的连锁关系的研究也比较多，但还没有一个能让大家普遍接受的研究成果。研究甜瓜2号连锁群中果长基因fl与性别表达基因a的连锁关系。【拟解决的关键问题】在甜瓜西州蜜和蛇瓜杂交组合的2号连锁群上，对果实长度基因fl与性别表达基因a进行定位，研究其与性别表达基因a的连锁关系，为实现在基因水平控制甜瓜果形，培育优良果形甜瓜新品种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

西州蜜和蛇瓜由新疆国家瓜类工程技术研究中心提供。西州蜜为雄花两性花同株，果实偏圆形，较短；蛇瓜为雌雄异花同株，果实长条形，偏长。

以短瓜、雄花两性花同株品种西州蜜为父本，以长瓜、雌雄异花同株品种蛇瓜为母本，二者杂交获得F1代。F1代再与西州蜜回交获得BC1代分离群体。2017年5月将170株BC1分离群体种植于昌吉试验田(87.383°E，44.166°N)，最终利用160株健康BC1分离群体对甜瓜2号连锁群果实长度基因fl与性别表达基因a进行初步定位。

1.2 方 法

1.2.1 甜瓜基因组DNA的提取

将170株BC1个体种植于田间，20 d后分别取直径小于5 cm的甜瓜幼嫩叶片样品，标记后置于冰盒中，于-80℃储存待用。提取170株BC1个体基因组DNA，基因组DNA的提取方法参照改进的CTAB法[27]。琼脂糖凝胶电泳检测提取甜瓜DNA的质量与浓度，将其稀释至100 ng/μL。

1.2.2 农艺性状的鉴定

选择160株健康的BC1个体，对其性别表达类型、果实长度进行鉴定和统计，以对性别表达基因a，果长基因fl进行定位。在甜瓜播种后45 d，对各植株留单瓜授粉并统计BC1群体各植株的性别表达类型。若植株中雌花存在雄蕊，则视为雄花两性花同株；若植株中雌花不存在雄蕊，则视为雌雄异花同株。在授粉后45 d，用直尺对各个植株留单瓜的成熟果实测量并统计其果长(果实纵径)。

1.2.3 甜瓜果长性状与性别类型性状遗传规律

将160株健康BC1个体的果实长度数据按照花性型分为雌雄异花同株和雄花两性花同株两组，用IBM SPSS statistics 22软件对两组数据进行差异显著性分析，分析两组之间果实长度的差异、差异的显著性。

将160株BC1个体的果长数据用IBM SPSS statistics 22软件绘制频率分布直方图，观察这160株BC1个体果长的频率分布情况，研究果长的遗传规律。

将160株BC1个体的性别表达类型统计结果(雄花两性花同株、雌雄异花同株)用IBM SPSS statistics 22软件进行拟合优度检验，分析这160株BC1个体的性别表达类型统计结果是否符合3:1的遗传分离比。

1.2.4 甜瓜长、短瓜池之间多态性标记的筛选

根据集团分离分析法(Bulk Segregant Analysis, BSA)，从BC1分离群体的160株个体中随机选出30个短瓜植株的DNA和30个长瓜植株的DNA，分别等量混合建成短瓜DNA池和长瓜DNA池(1.2.3中雄花两性花同株和雌雄异花同株两组之间果实长度差异显著性分析表明：雄花两性花同株植株果实较短，雌雄异花同株植株果实较长。即短瓜DNA池为雄花两性花同株DNA池，长瓜DNA池为雌雄异花同株DNA池)。使用前人报道的2号染色体上19个简单重复序列(SSR)分子标记引物以及29个新设计的SSR分子标记引物在两池之间进行PCR扩增，扩增结果通过非变性PAGE电泳，银染的方法检测。SSR分子标记的设计如下：采用SSRHunter1.3软件在SSR标记CMBR041和ECM61区间之内分析所有的SSR位点，选取重复基序总长大于12的位点，在其两端150 bp范围之内利用primer premier 5软件设计新的SSR引物。引物由北京华大基因研究中心合成。

1.2.5 多态性分子标记的检测

将筛选获得的多态性SSR分子标记引物对160株BC1个体DNA进行PCR扩增检测，PAGE电泳，银染的方法检测，记录每个个体的带型情况。单带型记为A，杂合带型记为H。如数据缺失用“-”表示。

1.2.6 果长基因fl、性别表达基因a的初步定位及连锁图的构建

将筛选获得的10个多态性SSR分子标记对160株BC1个体进行检测，记录分子标记的带型情况，获得基因型数据。使用QTL IciMapping v4.1作图软件对获得的基因型数据进行分析。遗传连锁图的参数设置：首先对10个多态性标记进行分组，分组的算法是LOD值为2.5，最大图距为50 cM。在10个多态性标记正确分组后，以nnTwoOpt命令对标记进行排序。初步排序后，以连锁群为单位重排标记。重排参数为相邻距离之和，染色体越短，重排效果越好。最后输出作图结果。

2 结果与分析

2.1 甜瓜果长性状与性别表达类型性状的遗传规律

160株BC1群体中雄花两性花同株和雌雄异花同株两组果实长度数据进行成组数据的t检验的结果显示，160株BC1群体中有112株雄花两性花同株植株，48株雌雄异花同株植株。所有雄花两性花同株植株的果实长度平均值为15.36 cm，所有雌雄异花同株的果实长度为16.58 cm，两组果实长度数据之间存在极显著的差异。表1

表1 160株BC1个体中雄花两性花同株与雌雄异花同株两组果实长度数据的差异显著性

Table 1 The difference significance analysis of fruit length between andromonecious and monoeciousgroupin160BC1plants

性别表达类型Sex expression type植株数Number of plants果实长度均值Average of fruit length标准偏差Standard difference标准误差平均值Average of standard error雄花两性花同株Andromonoecious11215.361.80.17雌雄异花同株Monoecious4816.58**1.930.28

160株BC1个体果长数据绘制的频率分布直方图显示，图中160株BC1个体果实长度分布呈现单峰，且为连续性变异，在西州蜜和蛇瓜的杂交组合中，果实长度的遗传为QTL遗传。图1

BC1个体性别表达类型数据符合3∶1的拟合优度检验的结果为，雄花两性花同株与雌雄异花同株分离比的卡方值为0.133，大于0.05，故差异不显著，即160株BC1个体中，雄花两性花同株与雌雄异花同株的分离比符合3∶1的分离比。表明在西州蜜和蛇瓜的杂交组合中，雄花两性花同株与雌雄异花同株的遗传不受单基因控制，推测其可能受双基因的遗传控制。表2

图1 160株BC1个体的果实长度频率分布

Fig.1 The distribution histogram of fruitlengthin160BC1plants

表2 160株BC1个体性别表达数据3∶1卡方检验结果

Table 2 The 3∶1 Chisquare test result of sex expression type (andromonecious, monoecious)in160BC1plants

性别表达类型Sex expression type观测的植株数Number of plants observed预期的植株数Number of plants expected残差Residual雄花两性花同株Andromonoecious118120-2雌雄异花同株Monoecious42402合计Sum1601600卡方 Chi-square自由度 Degree of freedom渐近显著性 Progressive significance0.13310.715

2.2 多态性标记的筛选

用共计48个SSR标记(前人报道的19个和自己设计的29个)在长、短瓜池之间筛序得到了10个多态性的SSR标记，多态率为20.8%，这10个多态性SSR标记的详细信息为，其中35号标记CMGA36、36号标记CMBR041、40号标记ECM61三个标记已有定位报道，这三个SSR标记可以作为锚定位点将研究建立的2号连锁群与国际上发表的其他遗传图的2号连锁群相对应。图2，表3

注：M表示500 bp marker；34-52为19对前人报道的SSR引物在长、短瓜池(雌雄异花同株、雄花两性花同株池)的电泳结果；2-1-2-31为29对新设计的SSR引物在长、短瓜池(雌雄异花同株、雄花两性花同株池)的电泳结果；对勾表示为长、短瓜池之间多态性条带的SSR标记

Note: M denotes 500 bp marker; 34-52 denotes the eletrophoresis result between the long fruit DNA pool(monoecious DNA pool) and the short fruit DNA pool (andromonoecious DNA pool) of 19 pairs of SSR primers that has been reported; 2-1-2-31 denotes the eletrophoresis result between the long fruit DNA pool and the short fruit DNA pool of 29 pairs of newly designed SSR primers; a tick denotes the SSR marker with the polymorphic bands between the long fruit DNA pool and the short fruit DNA pool

图2 聚丙烯酰胺电泳检测多态性的SSR标记

Fig.2 The polymorphic SSR markers detected by polyacrylamide gel electrophoresis

表3 10个多态性SSR标记的信息

Table 3 The information of 10 polymorphic SSR markers

标记编号Number of marker标记名称Name of marker上游引物Forward primer下游引物Reverse primer2-9SSRl27156ATAAGGCAAAAGGAAATCTAATCTATGTTAAATCAAAGGG2-11SSRl32201AAATGGTTTGGTATACTGAAGAGGAAGTCATAAAACTAAAAT2-12SSRl35092TGATCTTTCCGTAGTTGATACGTCTATTCTCCGTGTTGTA2-17SSRl47159AAAATTGGAGATTCTAAAGGAGATGAAATCAATAAGGCAC2-19SSRl52089TCAAATCCTAAACCCTAAACATGCACCTACTTGTTGTTGT2-21SSRl58093TGCCCAATGTTCATCTTTAACGAGCTAGTGTTTGCTGTCA2-23SSRl61100GTCAGTGGAACTACCAACCCTACCAAAATAATGTCAAGAG35CMGA36[4]TACATTATGGGTAAGGTAAGCCATCTCTTAACTTTCTCTC36CMBR041[28]GTACCGCCTAGGGTTTCTCCCGAGGAAGAGAGAGAAGGGG40ECM61[29]TTTCAAAAAGCGAACCAGCTATCGGACTCGATTACCAAACA

2.3 多态性分子标记的检测

将筛选获得的10个多态性SSR分子标记对160株BC1个体进行检测，所获得带型结果只有杂合带“H”和单带型“A”，符合遗传规律。如图3所示为2-17号标记SSR247159对BC1群体部分个体的PAGE电泳结果。

注：M表示500 bp marker; 1～96为1到96号BC1个体的PAGE电泳结果

Note: M denotes 500 bp marker; 1-96 denotes the PAGE result of 1-96 BC1plants

图3 2-17号标记SSR247159对BC1群体的个体检测

Fig.3TheindividualdetectioninBC1ofmarkerSSR247159

2.4 果形基因fl与花性型基因a的QTL分析及连锁图的构建

分别针对果实长度性状、性别表达性状，结合表型数据与基因型数据，用QTL IciMapping v4.1软件进行QTL分析，获得二者的QTL分析图，对于性别表达类型(雄花两性花同株、雌雄异花同株)的LOD变化，标记SSR227156和标记CMGA36之间对应的LOD值显著大于2.5，而且标记SSR232201处的LOD值超过了10，表明在此区间内非常可能存在一个控制甜瓜性别表达类型(雄花两性花同株、雌雄异花同株)的QTL。对于果实长度的LOD变化，标记SSR247159和标记SSR252089之间的LOD值大于2.5，但区间内的LOD值仅略高于2.5，表明该区间可能存在一个控制甜瓜果实长度的QTL。图4

通过QTL IciMapping v4.1软件，结合果实长度性状、性别表达类型的表型数据与10个标记的基因型数据，获得了包含2号连锁群8个多态性标记的连锁图，图中显示，两端标记SSR258093、ECM61与相邻标记之间的遗传距离大于30 cM，需要舍弃。在该连锁图中，这8个多态性标记跨越27.31 cM的遗传距离，两个标记间平均遗传距离为3.41 cM。在该连锁图中，性别表达类型QTL命名为a，定位在标记SSR227156和标记CMGA36间，遗传距离为3.59 cM；果实长度QTL命名为fl，定位在标记SSR247159和标记SSR252089间，遗传距离为3 cM；两区间之间的遗传距离为0.6 cM。图5

注：用十个多态性SSR标记在BC1分离群体的基因型数据结合果长、性别表达类型数据用QTL IciMappping v4.1 对二者进行QTL分析

Note: the QTLs associated with fruit length and sex expression type were identified basing on genotype data of 10 polymorphic SSR markers and phenotype data for the two traits in BC1in QTL IciMapping v4.1

图4 甜瓜果实长度与性别表达类型(雄花两性花同株、雌雄异花同株)QTL

Fig.4 The QTL analysis of fruit length and sex expression type in melon

注：图中空心长棒表示2号连锁群；长棒延伸线左侧表示两标记的区间，右侧表示各个标记的名称；黑色实心圆表示性别表达类型基因a可能的位点，黑色实心三角表示果长QTL可能的位点；a 表示andromonecious，FL表示Fuit Length

Note: the long hollow stick denotes Linkage Group 2; the intervals between two markers are shown on the left of the extened line through the Linkage Group 2, the names of the markers are shown on the right of the extended line; the black solid circle indicates the most likely position of sex expression type genea, the black solid triangle indicates the most likely position of fruit length QTL; a denotes andromonecious, FL denotes Fruit Length

图5西州蜜与蛇瓜BC1分离群体2号连锁群

Fig.5TheLG2linkagemapofBC1derivedfromXIZHOUMIandsnakemelon

3 讨 论

研究对西州蜜和蛇瓜BC1分离群体果实长度、性别表达类型(雄花两性花同株、雌雄异花同株)的遗传分析表明：果实长度的遗传为QTL遗传，这与前人的研究成果一致[10-12]；性别表达类型(雄花两性花同株、雌雄异花同株)的遗传受双基因遗传控制，这与Perin[4]、李威[24]发现性别表达基因a为单基因遗传是不同的。但研究定位的一个性别表达基因a位于2号连锁群这一结果是与Perin[4]定位结果一致的。至于另一个性别表达基因，研究团队后期将在西州蜜和蛇瓜BC1分离群体其他连锁群进行定位，验证另一基因是否如李威[24]的结果位于4号连锁群，以证实性别表达类型(雄花两性花同株、雌雄异花同株)受双基因遗传控制。在甜瓜中，一般雌雄异花同株植株果实长度较雄花两性花同株植株的果实长度要长[4,21,25]，这一现象在研究中也发现了。研究对果实长度基因fl和性别表达基因a的定位结果也表明二者处于紧密连锁的两区间，这可能是导致该现象的原因。

研究构建的2号连锁群的连锁图由8个SSR标记构成，跨越27.31 cM的遗传距离，两标记间平均遗传距离为3.41 cM。在筛选出的10个多态性SSR标记中CMGA36[4]、CMBR041[28]和ECM61[29]三个标记已有定位报道。由于在构建的连锁图中舍弃了ECM61，所以只有标记CMBR041和标记CMGA36可以作为锚定位点将本研究建立的2号连锁群与国际上发表的其他遗传图的2号连锁群相对应。

Wall[21]曾认为果形性状与花性型性状(雌雄异花同株与雄花两性花同株)是受一个复杂基因中紧密连锁的两个亚单元控制。2002年，Perin等的研究中[4]所作的遗传连锁图中，将性别表达基因a与果长QTLFl2.1共定位在2号连锁群的标记E40/M34_6与CMGA36之间，且两标记之间的遗传距离为25.2 cM。在研究获得的连锁图中，果实长度QTLfl定位在标记SSR247159和标记SSR252089之间，遗传距离为3 cM；性别表达QTLa定位在标记SSR227156和标记CMGA36/SSR235092之间，遗传距离为3.59 cM；两区间之间的遗传距离为0.6 cM。由于研究只有一个锚定标记CMGA36与Perin的标记相一致，且两基因的定位区间分别位于标记CMGA36的两侧，所以无法确定研究对两基因的定位哪一种是在C. Perin等定位区域之内。但研究将果实长度基因与花性型基因a初步定位于2号连锁群遗传距离分别为3 cM，3.6 cM的两个区间，定位区间更加精细，且两区间紧密连锁，遗传距离为0.6 cM。

由于目前甜瓜的育种材料大多数为雄花两性花同株类型[3]，如果需要获得F1杂交种就需要投入大量的劳动力在繁琐的人工去雄上[30]，这无疑增加了生产的成本。因此，有必要对具有优良性状甜瓜品种培育雌雄异花同株品种，从而避免自交的发生，节约成本。研究获得的针对性别表达基因a的紧密连锁标记SSR227156和标记CMGA36，可以在未来应用于分子辅助育种培育雌雄异花同株品种。

研究针对果实长度QTL初步定位在2号连锁群的标记SSR247159和标记SSR252089之间，遗传距离为3 cM。2015年卢浩等对甜瓜‘PMR6’抗白粉病基因的定位研究中将甜瓜抗白粉病基因pm-PMR6-1初步定位于12号连锁群的9.1 cM的区间内[31]。研究可参照卢浩等的方法进一步对该果实长度基因进行精细定位，在未来用分子辅助育种手段选育优良果形甜瓜新品种。

4 结 论

4.1 在西州蜜和蛇瓜杂交组合中，果实长度的遗传为QTL遗传，性别表达类型(雌雄异花同株、雄花两性花同株)不只受单基因控制，可能受双基因遗传控制。在性别表达类型(雄花两性花同株、雌雄异花同株)遗传中，雌雄异花同株对雄花两性花同株为显性。

4.2 在西州蜜和蛇瓜的BC1群体中，将果实长度基因fl定位在2号连锁群标记SSR247159和标记SSR252089之间，遗传距离为3 cM；性别表达基因a定位在2号连锁群标记SSR227156和标记CMGA36/SSR235092之间，遗传距离为3.59 cM；两区间之间的遗传距离为0.6 cM。证明二者不是同一基因。