金属离子及表面活性剂对土著菌产纤维素酶的影响

杨耀刚， 田瑞华

(内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010018)

纤维素是地球上极为丰富的生物聚合物，是生物质资源之一，它是由葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的线性不分枝的同聚多糖，纤维素是植物除水分以外的主要成分，约占其干质量的30%～50%，是目前分布最广且最多的天然碳水化合物[1]。

目前对纤维素有效的利用很少，其中一小部分用于纺织、造纸、建筑和饲料等，一部分用作生产燃料乙醇，大部分没有被利用，而是被农民取粒后直接焚烧，严重影响环境。秸秆自然还田，即生物降解是处理和利用秸秆等木质纤维素最具前景的方法，主要利用微生物可分泌产生纤维素酶这一特点，经微生物自然分解，参加自然界碳素循环，是增加作物产量、提高土壤肥力的有效途径[2]，但微生物受外界环境因素所致及自生可分泌的纤维素酶较少，且纤维素酶水解玉米秸秆的过程中，纤维素酶不可逆地吸附在木质素表面，使纤维素酶的活性降低，导致秸秆的分解速度变慢，这样存在降低地温、加重病虫害、影响播种等问题[3-4]。为加快纤维素的酶解速度，在纤维素酶解过程中添加表面活性剂来阻止木质素对纤维素酶的无效吸附，添加纤维素酶的激活剂金属离子来提高纤维素酶解的反应速度。

到目前为止，有很多与产纤维素酶生产菌的相关报道，如青霉、假单胞菌属、木霉属、曲霉属以及构建的工程菌，这些研究都集中在工业酶的基础上[5-6]，对于土壤自身土著菌微生物的研究甚少。在长期的生产实践中发现，植物细胞壁成分的复杂性及不同细胞壁成分的差异导致分解纤维素微生物单独作用下不能完成或只能微弱完成纤维素的降解，所以必须依靠2种及2种以上的微生物共同作用[7-8]。因此，本研究以玉米秸秆为原料，在不破坏原有土壤中降解纤维素菌群平衡的基础上，通过植物生长所需的金属离子及有利于土壤修复的表面活性剂对土著菌产酶条件优化的研究[9-11]，找出能够提高产酶效率的因子，制作成加速还田秸秆分解的菌剂，在秸秆还田时配施在土壤中，加快还田秸秆的有效降解，为提高土壤的肥力及增加农作物产量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

土样于2017年4月采自内蒙古自治区磴口县巴彦高勒镇周边玉米地，样品采集到无菌自封袋中，迅速压实挤掉多余空气，于4 ℃冰箱中保存；试验用秸秆采自当地农户家中，除去样品中的杂质，截成长度8～10 cm，带回实验室，粉碎，常温干燥环境条件下贮存，备用。

1.2 试验试剂

pH值为6.5的0.05 mol/L柠檬酸缓冲液、1%羧甲基纤维素钠溶液、DNS试剂(配制)；硫酸铁、硫酸亚铁、硫酸钠、硫酸锌、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰、氯化钙、氯化钴、硫酸钾，十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)、Tween 20、Tween 80、PEG 2000、PEG 6000、PEG 8000为化学纯。

1.3 土著菌的最适温度、pH值、氮源

将采到的土样各称取10 g于广口瓶中，加入已灭菌 490 mL 水、5 g秸秆粉、1 g微晶纤维素、1 g羧甲基纤维素钠、3 g尿素、3 g滤纸条，放置于常温，隔1 d摇晃1次，为1代菌。20 d后取50 mL 1代菌液，加入灭菌后的水450 mL、5 g秸秆粉、1 g微晶纤维素、1 g羧甲基纤维素钠、3 g尿素、3 g滤纸条，放置于常温，隔1 d摇晃1次，为2代菌，连续传代到第10代。各取第9代菌液20 mL，加入已灭菌80 mL水、0.5 g秸秆粉、0.2 g微晶纤维素、0.3 g羧甲基纤维素钠、0.1 g尿素、0.2 g滤纸条，于250 mL三角瓶中，2个平行，分别置于20、30、40、50 ℃，pH值为5、6、7、8，氮源尿素、硫酸铵、蛋白胨的恒温摇床中，50 r/min，测定酶活。

1.4 葡萄糖标准曲线的制作

制备不同浓度的葡萄糖标准溶液，分别加入1 mL DNS(3，5-二硝基水杨酸)溶液，摇匀，沸水浴5 min，冷却、定容到5 mL。在540 nm波长处测定其吸光度，以葡萄(mg/mL)为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线。

1.5 酶活的测定及计算方法

向比色管中加入0.5 mL、12 000 r/min离心后的上清，加入0.5 mL的1%羧甲基纤维素纳(CMC-Na)溶液，混匀后50 ℃水浴 45 min，加入1 mL的DNS液，沸水浴5 min，立刻冷却，加入 3 mL 蒸馏水，摇匀，取200 μL，540 nm波长下测定各溶液的D540 nm值。

纤维素酶活力定义：以CMC-Na为底物，在温度为 50 ℃、pH值为6.3、恒温45 min的条件下，以水解反应中 1 min 催化CMC-Na水解形成1 μmol葡萄糖的酶量为1个单位，用“U”表示。

1.6 不同金属离子对土著菌产酶的影响

试验考察植物在生长过程中所需的9种金属离子对纤维素产酶的影响，在土著菌群水解玉米秸秆的同时分别添加各自不同浓度的金属离子盐溶液与菌液充分混合(表1)，发酵7 d，根据上述方法测定其纤维素酶活力。

表1 添加不同金属离子的浓度梯度

1.7 不同表面活性剂对土著菌产酶的影响

向水解反应体系中加入不同浓度的6种表面活性剂，发酵7 d，根据上述方法测定表面活性剂在不同加入量下对土著菌产纤维素酶的影响。

表2 添加不同表面活性剂的浓度梯度

2 结果与分析

滤纸是结晶度和聚合度都居中等的纤维材料，滤纸酶活性即纤维素酶的总酶活力，以其为底物测滤纸崩解可用来表征纤维素酶的总糖化能力，因此对滤纸有良好降解效果的则具有较强的产纤维素酶能力[8，12]。故根据不同单因素下的滤纸崩解情况，确定土著菌的最适生长产酶温度为30 ℃、pH值为偏酸性、氮源为蛋白胨，含量为0.2%。葡萄糖标准曲线方程为y=0.791 6x-0.087 6(r2=0.995 2)(图1)。

2.1 不同金属离子对土著菌产酶的影响

在纤维素酶合成过程中，Fe3+是许多酶的激活剂，由图2可知，在发酵过程中，低浓度的Fe3+对土著纤维素菌剂产酶有促进作用，当Fe3+的浓度为0.3 mmol/L时，促进作用最强，此浓度下使纤维素酶合成水平有较大的提高。随着Fe3+浓度的增加，对土著菌产酶几乎没有影响。

由图3可知，低浓度的Na+能够促进土著菌产纤维素酶，从而有利于对秸秆的水解，当Na+浓度为0.7 mmol/L时，其相对酶活达到最大值，为111 U，随着溶液中Na+浓度的增加，对土著菌体的渗透压增高，抑制菌的生长，产纤维素酶下降，因此由促进转变为抑制。

在土著菌生长过程中，图4显示低浓度的Zn2+作为营养离子能够刺激土著菌加快完成生理代谢过程，有利于酶的合成，Zn2+的浓度为1.8 mmol/L时，酶活力达到最大值。当Zn2+的浓度高于1.8 mmol/L时，影响菌体对营养物质的吸收，不利于酶的合成，成为毒性离子，因此由促进作用变为抑制作用。

图5显示，Ca2+浓度在0.0～0.1 mmol/L时，对纤维素酶活力呈激活作用，且激活作用逐渐增加，从0.1 mmol/L开始，激活作用开始下降。在浓度大于0.1 mmol/L时，Ca2+对纤维素酶的作用转为抑制作用，抑制作用随浓度增大而加强。

由图6可知，Cu2+对纤维素酶活性整体呈激活作用，Cu2+浓度在0.0～0.9 mmol/L时，激活作用不显著，Cu2+浓度在1.0 mmol/L以后，激活作用开始增加。可能是因为Cu2+是构成漆酶不可缺少的金属离子，铜作为漆酶活力中心的组成成分，参与漆酶蛋白的合成，在限铜或缺铜时，漆酶蛋白表达受限，所以活力较低。在秸秆的分解中，漆酶降解玉米秸秆中的木质素，使秸秆中的纤维素暴露出来，间接地有利于土著菌对纤维素酶的分泌。

Mn2+能够参与细菌超氧化物歧化酶的活动，是锰过氧化物酶(MnP)、丙酮酸竣化酶、精氨酸酶等的辅助因子，也是腺嘌呤核苷酸酶和一些水解酶的激活剂，Mn2+对纤维素酶活力整体呈激活作用，Mn2+在浓度为0.3 mmol/L时，激活作用达到最大，以后开始减弱，但依旧表现为激活作用。

Co2+是微生物生长需要的具有特殊生物学功能的微量金属元素，其与微生物之间存在着密切的相互作用，在给定的范围内，对土著菌产酶具有促进作用。Co2+浓度为0.6 mmol/L时，其激活作用最强，随着环境中Co2+浓度增高，会影响甚至抑制微生物的生长及代谢活动，其激活作用呈下降趋势。

K+对土著菌产酶的影响与Na+相似，在低浓度是具有促进作用，当浓度为0.6 mmol/L时，其相对酶活达到最大值，随着环境浓度的升高，在微生物体内形成Na-K泵，影响土著菌的渗透压，因此变为抑制作用。

水解纤维素酶是蛋白质，物理、化学、生物等因子都能影响蛋白质空间结构的改变，金属离子对酶的催化作用尤其重要，金属离子主要通过影响底物反应定向或可逆改变金属离子的氧化态来调节氧化还原反应等途径参加催化过程[13]。国内外对此进行了研究，其结论有所不同，研究结果表明，金属离子对纤维素酶的影响除了金属离子本身以外，还与反应的条件及环境有关，在一定的浓度下有的表现为激活作用，有的则相反，何林富等在金属对林芝纤维素酶活力的研究中发现，K+、Zn2+对纤维素酶活有促进作用，Cu2+、Mn2+则对灵芝纤维素酶活有抑制作用[14]。王娜娜等在金属离子对纤维素酶水解玉米秸秆中研究发现，Ca2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+在一定的浓度范围内对纤维素酶有不同程度的促进作用[15]。安刚等研究金属离子对白蚁纤维素酶活力的影响发现，Na+、K+对酶活没有影响，Ca2+、Mn2+、Zn2+有激活作用，Cu2+有抑制作用[16]。李德莹等在金属离子对纤维素酶活力影响的研究发现，Fe3+、Co2+对纤维素酶活性有激活作用，Cu2+、Zn2+、Mn2+对纤维素酶活性有抑制作用[6]。李文欢等研究认为，Co2+、Mn2+对纤维素酶有激活作用，Cu2+、Ca2+对纤维素酶具有不同程度的抑制作用[17]。Ferchark等研究了金属离子对纤维素酶活的影响，结果表明，Ca2+对纤维素酶活也有轻微的激活作用[18]。王闻等研究认为，Ca2+、Mn2+、Co2+在一定浓度范围内对纤维素酶有激活作用，但效果不明显[19]。李金宝等认为，Fe3+、Cu2+、Co2+能够促进纤维素酶对纤维素的水解[20]。

2.2 不同表面活性剂对土著菌产酶的影响

表面活性剂能起到良好的增溶和乳化作用，可以降低纤维素及所处溶液的表面张力，使纤维素酶在整个反应体系中分散得更均匀，提高纤维素这种高分子聚合物的亲水性，并促进底物与纤维素酶结合，提高酶的降解效率[21-22]。

图7所示，添加非离子表面活性剂Tween 20、Tween 80时，对土著菌分解纤维素产糖在设定的范围内低浓度时有轻微的促进作用，Kim等研究发现，0.5% Tween 80能够使纤维素和滤纸的转化率分别提高21.9%、23.0%[23]。Tween可以增加底物与酶的有效结合，提高纤维素酶的热稳定性，且Tween 20强于Tween 80，随着添加浓度的增加，由轻微的促进作用变为抑制作用，这与Kaar等研究结果[24-25]类似。

添加不同分子量大小非离子表面活性剂PEG时，在设定的范围内对土著菌分解纤维素产糖低浓度有促进作用，其中PEG 6000提高幅度最大(图8)。Qing等对作用机制进行了研究[26]；Kristensen等在秸秆的水解中加入PEG，同样得到PEG 6000对秸秆水解的影响最大[27]。李鑫等在水解玉米秸秆中报道，PEG 6000减少纤维素酶的非生产性吸附，改善纤维素酶对玉米秸杆的水解性能效果最好[28]；席琳乔等在探究不同分子量大小PEG对棉秆木质纤维素酶解的影响中发现，同样得到PEG 6000可以提高纤维素的转化率[29]。

添加离子表面活性剂SDS，在设定的浓度范围内有明显的促进作用，当加入SDS加入量为6.85 mmol/L时，效果最好，相对酶活为169 U(图9)。王娜娜等同样发现，SDS对纤维素酶水解玉米秸秆有促进作用[15]。

金属离子与表面活性剂对土著菌产纤维素酶的试验结果与其他学者研究结果不尽相同，可能主要有2个原因：一是不同微生物源所产生的纤维素酶结构上有差别；二是不同的研究者所设定的金属离子及表面活性剂浓度不同。

3 结论

通过试验初步探索土著菌生长产酶的最适环境，混菌的产酶最适pH值为偏酸性，温度为30 ℃，最适产酶的氮源为蛋白胨，其含量为0.2%。本研究只在单因素水平上探索不同的金属离子与表面活性剂对土著纤维素菌产酶的影响，试验结果表明，金属离子与表面活性剂在一定的浓度范围内对秸秆的水解具有促进作用，可以提高土著纤维素菌剂对秸秆的有效降解速度，在玉米秸秆还田时配施菌剂，从而提高土壤的肥力，增加农作物产量。然而金属离子复配对纤维素菌产酶的研究较少，只有李文欢等研究2种金属离子的复配，结果表明，比单独添加1种金属离子效果好[17]。因此，金属离子复配以及金属离子与表面活性剂相结合对纤维素菌产酶的影响有待不断地深入研究。