非小细胞肺癌表皮生长因子受体靶向治疗中的自噬调控研究进展

尹东涛，云天洋，刘 阳

1解放军总医院 胸外科，北京 100853；2火箭军总医院 胸外科，北京 100088

肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占80%。由于大多数非小细胞肺癌患者在就诊时已属晚期，故总体的治疗效果不理想[1]。近年来，以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂为代表的靶向治疗在NSCLC中显示了很好的应用前景，但多数患者在用药6 ～ 12个月时会发生“获得性耐药”使疗效受限[2]。NSCLC靶向治疗耐药的机制有多种，如EGFR基因20外显子T790M突变、g-MET基因扩增、组织学上的小细胞转变等。最近的研究表明，细胞自噬(autophagy)在肿瘤放化疗和靶向治疗耐药的过程中发挥了重要作用[3-5]。本文就以EGFR为靶点的非小细胞肺癌靶向治疗中的自噬调控研究进展作一综述。

1 自噬的概念

自噬是指细胞为适应某种环境或刺激，降解自身细胞质成分和细胞器，以维持细胞新陈代谢和生存的正常生理过程[6]。细胞自噬共有3种形式，巨自噬(macroautophagy)、微自噬(micro-autophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy)。巨自噬是指在蛋白质、脂类或其他细胞器周围首先形成双层膜结构的自噬小体，之后自噬小体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体并降解，使细胞内的成分得到循环的过程，是目前研究最广、最常见的自噬形式，也是本综述所指的自噬。自噬在细胞内稳态、癌症、心力衰竭、神经退行性疾病、传染病、衰老相关性疾病等过程中都发挥了重要作用，成为继凋亡(apoptosis)之后生命科学最热门的研究领域之一[7]。

在肿瘤的不同阶段，细胞自噬发挥着双向的调节作用。在正常细胞中，低水平自噬通过减少蛋白质积聚、清除氧自由基等方式抑制肿瘤的发生；而在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞基础自噬水平的提高，是保证其在营养缺乏或抗肿瘤药物作用等恶劣环境下存活的重要机制之一，也称为“保护性自噬”[8-9]。过度的自噬又能够引起自噬性细胞死亡，常被称为“Ⅱ型程序性细胞死亡”以区分于“Ⅰ型程序性细胞死亡”，即“凋亡”。在肿瘤治疗的过程中，往往伴随着肿瘤细胞自噬水平改变，而这种改变也影响了肿瘤治疗的效果。这一特点使人们对细胞自噬这一新的肿瘤治疗靶点充满了期待[10]。

2 自噬在非小细胞肺癌靶向治疗中的作用

2.1 非小细胞肺癌的EGFR靶向治疗现状 EGFR是一种由胞外区、跨膜区和胞内区组成的糖蛋白，其胞内区含有ATP结合区和酪氨酸激酶区。NSCLC患者EGFR基因的过表达率约为62%[11]。EGFR基因通过磷酸化激活后，可以引起下游如Ras/Raf/MEK/MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT/Mtor、NCK/PAK/JNK等多条信号通路的激活，促进肿瘤细胞的增殖[12]。随着分子生物学的发展，以EGFR基因为靶点的靶向治疗得到了广泛的关注，并取得了令人鼓舞的临床结果[13]。靶向治疗优势有作用靶点明确、不良反应程度轻、起效快、患者依从性好等。目前用于临床治疗NSCLC的主要靶向药物有： 1)表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)，代表药物有第一代TKI吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)，第二代TKI阿法替尼(afatinib)，以及第三代的AZD9291等； 2)抗EGFR单克隆抗体，代表药物西妥昔单抗(cetuximab)； 3)间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂，代表药物克唑替尼。患者在接受靶向治疗的过程中，多数在1年之内发生获得性耐药(acquired resistance)，还有一些患者存在原发性耐药的因素，使靶向治疗的效果受到限制。目前发现的耐药机制主要包括K-RAS基因突变、EGFR T790M突变、c-MET基因扩增，以及组织学上的小细胞转变等，但仍有一些耐药机制尚不明确[14]。

2.2 细胞自噬与非小细胞肺癌EGFR靶向治疗的耐药 靶向药物能够诱导细胞自噬最早由Ertmer等[15]在伊马替尼治疗慢性粒细胞性白血病的研究中提出。2011年，Han等[16]首次报道了吉非替尼或厄洛替尼在肺癌细胞中对自噬的激活作用，比较了对EGFR-TKI相对耐药和相对敏感的两种肺癌细胞系，在相对耐药的EGFR野生型细胞系A549中检测到自噬，而相对敏感的细胞系中未检测到自噬；通过自噬抑制剂氯喹(CQ)或敲除自噬相关基因ATG5或ATG7的办法抑制自噬，可恢复A549细胞对靶向药物的敏感性，由此证实了自噬可能是EGFR野生型肺癌细胞对TKI耐药的原因。Zou等[17]也发现，氯喹能够明显增加厄洛替尼对野生型EGFR肺癌细胞的细胞毒作用，而通过抑制自噬有望扩大靶向药物在野生型EGFR的NSCLC中的应用。

细胞自噬调节不仅与非小细胞肺癌靶向治疗中的原发性耐药有关，还与获得性耐药密切相关[18-19]。EGFR外显子19缺失突变的HCC827细胞(TKI敏感型)经1μmol/L吉非替尼作用并连续传代20次以上，获得对吉非替尼耐药的细胞株，经测序证实与亲代细胞具有相同的突变序列，并且未发生T790M及C-MET扩增这两种常见获得性耐药机制，研究人员发现获得性耐药的子代细胞基础自噬水平显著高于亲代，而抑制自噬可以抑制子代细胞的增殖，证实了自噬作为一种独立的获得性耐药机制在靶向治疗中发挥作用[20]。

细胞自噬在靶向治疗中不仅表现为“保护性自噬”，也能够产生细胞毒效应。研究表明，联合使用异羟肟酸(SAHA，一种组蛋白脱乙酰酶)和第3代TKI，能够增强自噬介导的细胞死亡及细胞凋亡，从而明显增强对EGFR T790M突变的肺癌细胞的抗肿瘤效果[21]。这项研究让我们看到了“双刃剑”的另一面。Fung等[22]研究发现，自噬诱导剂雷帕霉素可以部分恢复耐药肺癌细胞对TKI治疗的敏感性，认为自噬下调或缺失可能是TKI耐药的机制之一，而诱导自噬的途径则可能在增强TKI疗效方面发挥作用。

靶向药物与传统化疗联合以提高单药治疗的效率，在临床前研究中取得了较好的结果，但在4个大型Ⅲ期随机临床试验中，联合用药较单药并未取得明显的临床获益。Liu等[23]研究发现，靶向药和化疗药物之间的拮抗效应影响了临床结果，而自噬是拮抗效应的机制之一，通过抑制自噬有望解决这种拮抗效应，从而给临床治疗带来新的思路。

2.3 自噬调控非小细胞肺癌EGFR靶向治疗的机制 作为细胞膜蛋白EGFR同样可以定位于细胞核和细胞质中。研究表明，线粒体也可以表达EGFR，而且EGFR在线粒体表达与自噬和凋亡的调控密切相关[24]。EGFR下游的信号通路如MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT/mTOR、NCK/PAK/JNK和PLC/PAG/PKC等均参与了自噬的调控[25]。AMPK/mTOR是EGFR和自噬调节通路的共同靶点，AMPK抑制剂或敲除AMPK基因均可以显著阻断吉非替尼对NSCLC自噬的诱导作用，很好地解释了EGFR和自噬调节的密切关系[26]。

p53也是自噬调控的重要因子之一。在细胞核中，p53作为核转录因子，与腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、死亡相关蛋白激酶1、损伤调节自噬调控基因(damage-regulated autophagy modulator，DRAM)等多种自噬调节分子的基因启动子区结合，促进这些靶基因的转录，进而促进自噬；而在细胞质中，p53主要通过激活mTORC1抑制自噬。最近一项研究发现，白藜芦醇(一种天然的多元酚化合物)能够增加吉非替尼对PC9/G(对吉非替尼耐药的PC9细胞)的抗肿瘤效果，p53介导的自噬和凋亡在其中发挥了关键作用[27]。

mTOR是哺乳动物雷帕霉素的靶点，对细胞的生长、增殖、存活都具有重要的调节作用，其上游和下游各有多条信号通路，在自噬中主要起负向调控作用。靶向药物吉非替尼正是通过阻断PI3K/AKT/mTOR通路而诱导肺癌细胞的自噬和凋亡[28]。

3 自噬调节剂在NSCLC EGFR靶向治疗中的应用

氯喹(chloroquine，CQ)和羟氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)原属于抗疟药物，它们均通过提高溶酶体内pH值抑制溶酶体酸化发挥抑制细胞自噬的过程，是目前研究中应用最多的自噬抑制剂。CQ不仅具有直接的抗肿瘤作用，还可增强肿瘤对化疗及放疗的敏感性。临床前研究表明，CQ能够提高TKI对野生型EGFR及获得性耐药NSCLC的抗肿瘤效果[17,20]。然而，由于其胃肠道反应与眼毒性等不良反应，临床应用受到很大限制。HCQ是氯喹的类似物，其不良反应相对CQ较少。一项HCQ与厄洛替尼联合治疗晚期NSCLC的Ⅰ期临床试验中研究了HCQ的安全性及最大耐受剂量，认为HCQ 1 000 mg/d与厄洛替尼150 mg/d联用是安全可行的[29]。但Leung等[30]对7例参与了厄洛替尼联合HCQ治疗晚期NSCLC临床研究的病人进行观察，发现其中2例患者分别于服药的11个月和17个月时出现了视网膜毒性。而且，有报道大剂量的HCQ对自噬的抑制效果在体内与体外试验中并不一致[31]。因此，CQ和HCQ用于临床可能还需要时间。

质子泵抑制剂(proton pump inhibitor，PPI)一直用于消化道溃疡的治疗，但多项研究表明PPI不仅具有抗肿瘤活性，而且能够提高化疗药物的敏感性，而主要机制即是通过抑制细胞自噬[32]。有研究认为PPI类药物会影响TKI的吸收效率，但对TKI治疗NSCLC的最终疗效是否产生影响目前尚存在争议[33-34]。

Sugita等[35]发现，大环内酯类抗生素能够通过抑制自噬增强EGFR-TKI对NSCLC的非凋亡途径的细胞毒作用；并且在EGFR-TKI对胰腺癌细胞的治疗中也有同样的作用[36]。大环内酯类药物临床应用广泛，安全性好，有望为NSCLC的靶向治疗耐药带来新的突破。

此外，还有很多对自噬有调节作用的药物，如雷帕霉素、依维莫司、硼替佐米、三氧化二砷和姜黄素等。它们能否作为非小细胞肺癌靶向治疗的辅助用药，临床安全性如何，尚有待更多的研究证实。

4 结语

细胞自噬是细胞自身对外界环境变化如缺血、缺氧、理化因素及药物刺激等的一种适应性反应，靶向治疗以及其他多种肿瘤治疗方法均可以诱导细胞自噬的发生，并导致肿瘤细胞对治疗的耐受。细胞自噬调节有望为靶向治疗耐药的解决带来一种新的方法。当然，自噬调节剂与靶向治疗联合应用的确切效果尚需要更多临床前及临床研究验证，同时也期待发现更多新型、安全有效的自噬调节剂。

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