DNA分子标记在无核葡萄育种中的应用

王爱玲

分子标记（molecular marker）是以生物的某些大分子物质（主要指核酸）的多态性为基础的遗传标记。它们能够稳定遗传，且遗传方式简单，可以反映生物的个体和群体特征。DNA分子标记是目前发展最为迅速的一类遗传标记，现已有许多成熟的技术出现，并在植物遗传育种领域得到广泛应用。

20世纪60年代以来，分子标记技术作为一种新型的遗传标记在生物的遗传育种和遗传研究等方面发挥了越来越重要的作用。在众多的DNA分子标记中，RAPD技术以其快速、准确、灵敏的特点一经产生即在生物学研究领域中得到重视和广泛应用。在果树上，由于其生命周期长、自交育性低、个体杂合度高、植株占地面积大等特点，给普通遗传学研究带来了很大困难，因此，对果树的遗传规律研究采用先进的分子标记技术进行遗传研究和早期选择显得十分迫切和重要。

1 DNA分子标记

1.1 DNA分子标记类型 DNA分子标记主要包括：DNA限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、序列特异性扩增区域（SCAR）、扩增产物切割多态性标记（CAPs）、抗病基因类似物标记（RGA）等，其中葡萄上应用最多的是RAPD标记。

获得与目标性状相连锁的DNA标记，通常采用两种方法，即近等基因系法(NILs)和集群分离分析(BSA)法。由于近等基因系群体的获得需要多代回交，在育种周期和童期相对较长的果树植物上难以应用，而BSA法则直接利用F1分离群体，将目标性状分为2组，每组中各个体DNA等量混合，形成两个除目标性状外遗传背景相同的DNA池，然后寻找差异DNA片段,再进行个体验证即可获得，目前BSA法已成为葡萄等果树重要农艺性状DNA标记获取的主要途径。

1.2 无核性状分子标记 在葡萄育种过程中，无核性状一直备受关注，随着分子生物学技术在葡萄上的广泛应用，对无核性等一些重要性状的分析已不再局限于以往的形态学指标和同工酶、染色体核型分析等常规手段，许多研究者开始转向分子标记和遗传图谱的构建，并获得了一些与无核基因相连锁的DNA分子标记。王跃进等利用BSA方法获得了葡萄无核基因连锁的RAPD遗传标记UBC269519&UBC269484之后，根据DNA序列设计合成了可用于检测无核基因的18 bp特异探针GSLP1，用于检测了葡萄无核性状。Lahogue等通过对“无核白”的研究，获得了与无核基因连锁的RAPD标记和SCAR标记,成功地检测了葡萄无核基因及其性状。Scott等首次利用AFLP技术对火焰无核的突变体进行早期鉴定，获得了2个特异性引物。

2 DNA分子标记在无核葡萄育种中的应用

2.1 无核葡萄育种 无核葡萄原产于中亚，一般在气候温暖的地区都能正常生长，且结果良好。目前主要栽培于西亚中亚各国（如希腊、土耳其、伊朗、伊拉克、叙利亚和阿富汗等）、美国加州和澳大利亚等。我国主要分布于新疆的吐鲁番、鄯善、哈密和和田地区，其产量和栽培面积占全国总量的半数以上。目前，无核葡萄主要用于制干和鲜食。

无核葡萄是葡萄浆果基本上无核，或带一点很小而软的残核。无核葡萄含糖量高，食用方便，风味独特，品质优良。葡萄的无核性状是葡萄生产中重要的商品特性，世界各国人们消费的趋势是无核、大粒，无核葡萄所创造的经济价值也占有重要地位。因而，无核葡萄育种一直是葡萄育种的重要方面。

无核葡萄育种主要采用传统的常规杂交方式，并借助传统的形态学方法进行选择，这种组合方式和选择手段，不仅获得的无核单株率低，而且费时耗力，选择效果极差。后来，Ramming等人采用无核×无核崭新的杂交组合方式，结合胚挽救技术，获得了较高的无核株率，而且较常规传统技术至少节省时间5年，提高育种效率40倍以上。目前我国无核葡萄育种还是比较落后的，仍采用传统育种方法，如北京植物园选育的京早晶。新疆通过营养系选种选育的大穗无核白等仍不能满足生产对品种多样性的需要。

2.2 国内DNA分子标记在无核葡萄育种中的应用 在无核葡萄遗传标记研究上,王跃进等采用BSA法对B72-216×B45-187及其64株杂交后代筛选UBC随机10 bp引物100个,发现UBC-269扩增产生的约500 bp多态性片段与无核主基因之一相连锁,从而获得了葡萄无核基因的RAPD标记。在此基础上,采用细菌质粒M13克隆了该片段并测序,设计合成了用以探测葡萄无核基因存在与表达的18 bp特异探针,用它对获得标记的组合、国际商品栽培品种、无核×无核组合（G78-47×B52-122）的后代进行RAPD扩增,结果表明,凡拥有约590 bp多态性片段的均为葡萄无核基因的携带者和无核性状的表达者,因此得到了探测葡萄无核基因存在与否的RADP标记和探针。该RADP标记和探针的获得是葡萄无核基因研究与品种选育分子水平上的重大突破,并首次成功地以该标记和探针用于检测葡萄无核基因的存在与否,RAPD标记可在幼苗期对育种材料进行早期鉴定,RAPD探针可在无核葡萄育种中用作检测无核基因存在与否的有效手段。

2.3 国外DNA分子标记在无核葡萄育种中的应用 在葡萄无核标记研究上,国外也有人做过探索。以色列的Striem使用160个引物对Early Muscat×Flame Seedless的82个后代进行RAPD分析,结果发现了12个RADP标记与7个反映葡萄无核性状的指标表现出紧密的连锁关系,多元线性回归系数为R=0.779；并用其中的7个标记的两步法淘汰了44%的有核个体,减少了杂种后代近一半的个体,提高了育种效率。Lahogue F.等利用以RAPD标记和SCAR标记对欧洲葡萄Sultanina在土质肥沃情况下表现无核的情况进行研究,得到了与主效显性基因紧密连锁的RAPD标记 (遗传距离分别为0.7 cm和3.5 cm),并且把最近的标记转化为共显性的SCAR标记SCC8,所有有核的后代表现为SCC8-/SCC8-,所有无核的后代表现为SCC8+/SCC8+,从而成功地检测了葡萄无核基因及其性状。

无论是国内还是国外的研究者,他们均对葡萄无核的遗传规律做出了新的、有益的探索,并结合RADP技术及其遗传标记对葡萄无核基因的存在与否进行DNA分子水平的检测,这些工作的开展,无疑推动了对葡萄无核遗传规律的认识、无核育种效率的提高。

3 展望

DNA分子标记，无论理论还是实践都十分有价值。它使人们对基本遗传成分的观察进入了一个更深的层次,从而使人们对某些性状遗传规律的分析更加详实、更加可靠,亲本选配更符合育种目标。此外,在了解起源及进化关系、品种鉴别、品种保护等方面都有很广阔的应用前景。随着分子标记技术的不断完善和发展,连锁遗传图的构建已不再是少数几种作物的专利,包括多年生果树(葡萄、苹果、核果类果树等)在内的不少园艺作物都已拥有各自的分子图谱。分子标记技术目前最有价值的实际应用是 “分子标记辅助育种”,通过分子标记使早期选择、预测成为可能,同时某些不易区分的性状也可以通过遗传标记的间接选择来达到目的。对某些不期望的性状也能够及时地发现和淘汰。随着研究手段与技术的改进,标记的基因将被克隆、转移到目标葡萄品种上,形成新的转基因葡萄品种,特别是在今后获得一批抗逆或有益于人体健康有关的特异品种。可以预料,DNA分子标记技术将在葡萄科研中发挥越来越重要的作用。

（参考文献略）