miRNA在肝脏脂代谢和脂代谢紊乱性疾病中的作用

文若剑，乐 凯，易卉玲，陈晓青

（江汉大学 a.医学院；b.武汉生物医学研究院，湖北 武汉 430056）

脂代谢为三大营养物质代谢之一，主要包括胆固醇及其酯代谢、甘油三酯（triglyceride，TG）代谢、磷脂和糖脂代谢。脂代谢过程复杂，涉及大量的蛋白酶、受体和转录因子，这些调节因子参与了各种信号转导过程。脂代谢信号转导涉及的途径主要有3条：过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）途径、肝X受体（liver X receptors，LXRs）途径和胆固醇调节元件结合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins SREBPs）途径。PPARs包括3种亚型：PPARα、PPARβ和PPARγ，其中PPARα在肝脏脂代谢中调控多个环节的基因表达，PPARβ分布比较广泛，能够参与巨噬细胞中胆固醇的代谢［1］，PPARγ在脂肪组织高表达，对其调节脂代谢的研究集中于脂肪细胞。LXRs是核受体超家族转录因子成员之一，包括LXRα和LXRβ两个同源亚型，主要启动细胞中胆固醇输出相关基因的转录，如三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）、三磷酸腺苷结合盒转运体G1（ATP-binding cassette sub-family G member 1，ABCG1）、胆固醇-7α羟化酶（cholesterol-7 alpha hydroxylase）等，促进胆固醇逆转运和胆固醇向胆汁酸的转化，增加肠道胆固醇的排泄并抑制其吸收［2］。胆固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding protein，SREBP）家族是脂质代谢的重要转录因子，参与调节胆固醇和脂肪酸生成和吸收过程中的多个基因表达［3］。目前已经发现3个亚型：SREBP1a、SREBP1c和SREBP2，SREBP1c主要调节脂肪酸合成相关基因的表达，而SREBP1a和SREBP2则调节胆固醇代谢相关基因的表达。肝脏是机体中脂代谢调节的主要器官，在脂类的消化、吸收、合成、分解与运输中均具有重要作用，脂代谢失调会导致一系列代谢紊乱性疾病如脂肪肝、高血脂和肥胖症等，也是心血管疾病的危险因素。有关肝脏脂代谢以及脂代谢紊乱的确切机制尚未完全明确，近年来发现非编码小分子RNA（miRNA）对脂肪组织的生长发育、脂代谢相关途径等均能产生影响，并且调控方式多样，作用靶点广泛，因此miRNA在肝脏脂代谢中的作用也越来越引起人们的关注。

1 miRNA在肝脏脂代谢中的作用

miRNA是一类内源性的非编码小分子单链RNA，广泛参与细胞增殖、分化、发育、代谢和凋亡等多种基本生命活动。miRNA具有高度序列保守性、表达时序性和组织特异性的特征，通过miRNA识别元件（miRNA recognition element，MRE）结合于靶mRNA的3′-UTR区域，通过介导靶mRNA降解或翻译抑制来调节靶基因的表达［4］。miRNA水平对于维持胆固醇及脂质稳态的动态平衡至关重要，就已有研究而言，miR-33、miR-27以及miR-378等miRNA参与了脂质合成以及运输过程，而miR-122、miR-370等miRNA主要在脂质合成以及氧化利用过程中起作用，近期报道miR-128、miR-144、miR-370、miR-613、miR-618、miR-758等miRNA也参与了细胞或机体脂质代谢的调节。

作为目前研究最深入的miRNA之一，miR-33参与了多个脂代谢调控环节。SACCO等［5］研究证实miR-33除了参与脂肪酸β氧化蛋白的翻译，减少脂肪酸的降解外，还能够调节胆固醇的流出和高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）的生物合成。与miR-33功能相似，ADLAKHA等［6］研究表明miR-128-2能直接结合ABCA1、ABCG1基因3′-UTR端从而发挥抑制其蛋白表达的作用。ZHONG等［7］在miR-613发现不久后证明miR-613通过负向调控LXRα来调节LXRα下游的一系列转录因子如SREBP-1c、碳水化合物反应元件结合蛋白（carbohydrate-responsive element-binding protein，ChREBP）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）的表达进而影响脂质合成。早期研究显示miR-27可以抑制细胞中脂代谢相关基因的表达，如PPARγ、视黄醛X受体α（RXRα）、脂联素、CD36、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）和SREBP1c 等［8］。miR-27有miR-27a、miR-27b两种亚型，JI等［9］发现miR-27a通过下调其靶蛋白的表达参与脂质的从头合成，CHEN等［10］证实抑制miR-27b可以通过调节PPARγ-LXRα-ABCA1信号通路来影响动脉粥样硬化形成过程。miR-29家族是肝脏和胰腺中表达水平最丰富的miRNA之一，MASSART等［11］的研究表明，miR-29能靶向调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1-α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α）来参与调节脂肪酸氧化过程。SUN等［12］在人类和鼠的巨噬细胞中分别证实了miR-26可以通过LXR途径抑制ABCA1蛋白的表达，体外抑制miR-26后能够显著提高细胞内ABCA1蛋白的水平。RAMIREZ等［13］也证实了miR-758在人类和小鼠的巨噬细胞中同样具有抑制ABCA1表达，减少细胞胆固醇流至载脂蛋白AⅠ（apolipoprotein AⅠ，apoAⅠ）的作用。上述相关研究显示多数miRNAs在调节脂代谢过程中都会涉及到脂蛋白代谢和胆固醇稳态的维持，因此本综述重点介绍miRNA介导HDL、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和极低密度脂蛋白（Very low-density lipoprotein，VLDL）代谢的重要发现和最新进展。

2 miRNA调控HDL代谢

胆固醇是哺乳类动物细胞膜的主要成分之一，由于胆固醇不能被降解，哺乳动物细胞会将多余的胆固醇从外周组织清除到肝脏，再利用胆固醇的逆行转运（reverse cholesterol transport，RCT）将其排泄到粪便中［14］。在肝和小肠中合成的HDL被认为是RCT过程中一个重要的转运体，目前多采用高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）含量来表示血浆HDL的水平，HDL-C水平越高，机体逆向转运胆固醇的能力越强，胆固醇蓄积的可能性越小，脂代谢性紊乱发生的概率也就越低，因此，HDL的代谢过程及其调控机制备受关注，而miRNA在其中的作用也得到越来越多研究的证实［15-16］。一些miRNAs，如miR-33a/b、miR-144、miR-148a、miR-128和miR-223都是HDL的重要调节因子，能够直接参与细胞胆固醇外流、HDL的生物合成、肝脏HDL摄取和胆汁酸合成。

miR-33家族包含两个亚型miR-33a和miR-33b，分别由SREBP2和SREBP1内含子编码。当SREBP被激活时，miR-33a和miR-33b被转录，并参与到细胞胆固醇外流、HDL合成过程中发挥调控作用［17］。miR-33和胆固醇代谢相关性最初的研究显示miR-33在小鼠肝细胞和巨噬细胞中均能调节ABCA1和ABCG1的表达。ABCA1转运细胞内的胆固醇至细胞外的ApoAⅠ并形成前β-HDL，这是合成HDL的第一步，而ABCG1能够协同ABCA1完成整个HDL合成代谢过程。由于ABCA1的mRNA和蛋白质半衰期非常短（1～2 h），为了应对外界环境的变化，miRNA的转录后调控机制尤为重要，在啮齿类动物和非灵长类动物的肝脏内如果过表达miR-33会导致ABCA1和ABCG1的表达减少，同时伴有血浆HDL-C水平降低，用反义寡核苷酸抑制剂降低miR-33水平则肝脏ABCA1和ABCG1以及血浆HDL-C的表达增加［18-19］。然而也有研究发现和野生型小鼠相比，miR-33b基因敲除小鼠体内miR-33的靶基因如ABCA1、ABCG1和SREBP-1的水平降低，胆固醇流出能力减弱，同时血浆HDL-C水平降低了35%［20］。值得注意的是：KARUNAKARAN等［21］发现在动脉粥样硬化发生时，miR-33主要靠调节线粒体的能量状态来影响胆固醇流出，抑制miR-33会上调PGC-1α、丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4（pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4，PDK4）及溶质载体家族25（solute carrier family 25，SLC25）这些调节因子来增加线粒体呼吸和ATP产生，从而促进胆固醇流出。这项研究表明，miR-33影响胆固醇流出的能力在动粥样硬化形成过程中与调节ABCA1和ABCG1的表达并无关联。除了通过RCT调节脂质积累，OUIMET等［22］最近报道，在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞内，miR-33能通过抑制溶酶体降解来促进脂质蓄积，过表达miR-33抑制结核分枝杆菌的自噬，靶向调节参与自噬体形成的一系列基因，如自噬蛋白5（autophagy protein 5，ATG5）、微管相关蛋白1轻链3β（microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，MAP1LC3B）、溶酶体相关膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1）和溶酶体酸性脂肪酶（lysosomal acid lipase，LIPA），从而抑制脂肪酸氧化，促进脂质体的形成。另一项研究中，LAI等［23］发现miR-33还能提高巨噬细胞膜脂筏的含量和增强被脂多糖激活的核转录因子NF-κB的活性，反过来，脂多糖也能抑制miR-33表达，并伴随着SREBP2的明显下调。

除了 miR-33，还有一些 miRNAs如 miR-758、miR-144、miR-26、miR-27a/b、miR-302a、miR-148a、miR-128-1、miR-19b也相继被证明从不同方面调节了HDL-C的代谢过程［24］。VICKERS等［25］研究显示miR-144通过转录后水平抑制ABCA1的表达，控制胆固醇流出，而和miR-144相关的另一项研究则提出了调节HDL-C代谢的一个新通路，涉及miR-144、ABCA1和法尼醇X受体（farnesoid x receptor，FXR）3个关键因子。该项研究发现在小鼠肝脏内升高miR-144水平，肝ABCA1和血浆HDL-C水平降低，相反，沉默miR-144则肝脏ABCA1和HDL-C水平升高，而miR-144上游有一个功能性FXR反应元件，核受体FXR能够结合反应元件并调控miR-144，在肝脏完成降血脂的作用［26］。ABCA1是血浆HDL-C水平的主要决定因素，miR-148a也有助于ABCA1的转录后调控，miR-148a在小鼠和人类的肝脏组织中高表达，在小鼠体内抑制miR-148a能增加肝ABCA1表达和血浆HDL-C水平，而过表达miR-148a则明显降低血浆HDL-C和肝脏ABCA1水平［27］。在不同条件下miRNA调节血浆HDL-C水平的模式会发生改变，例如，以往研究证实miR-27a/b通过调节ABCA1水平影响肝细胞和巨噬细胞胆固醇流出，然而，在高脂饮食条件下调控miR-27b却并不影响血浆HDL-C水平，可能是因为miR-27还能同时靶向结合其他脂代谢相关基因如血管生成素样蛋白3基因（lipidrelated genes angiopoietin like 3，ANGPTL3）和3-磷酸甘油酰基转移酶（lycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAM），从而抵消ABCA1对HDL-C水平的调节作用［28-29］。

促进细胞中胆固醇外流和RCT是HDL最主要的生理功能，也是HDL抗动脉粥样硬化的基础。HDL-C从外周组织输送到肝脏，有选择地被B族I型清道夫受体（scavenger receptor class B type I，SR-BI）摄取是RCT的关键一步。SR-BI是第一个在分子水平上被证实具有生理学效应的天然膜受体，也是在肝脏中高表达的功能性HDL受体，SR-BI的经典作用是通过RCT介导高密度脂蛋白—胆固醇酯（HDLCE）的选择性摄取，这一过程是RCT的最后一个限速环节，因此一些miRNAs能通过调节SR-BI的表达来影响肝脏摄取HDL。研究表明，miR-125a-5p和miR-455在类固醇生成细胞中能够直接靶向调节SR-BI的表达，细胞转染pre-miRNA-125a或pre-miRNA-455后会同时在转录和翻译水平抑制SR-BI表达，降低HDL-CE的选择性吸收［30］。miR-185、miR-96和miR-223这3种miRNA同样被确定为SR-BI的调节因子，它们能结合SR-BI的3′-UTR端从而调节肝细胞摄取胆固醇功能，肝细胞过表达miR-185、miR-96和miR-223均能显著降低SR-BI蛋白水平，同时也降低了肝细胞对HDL的摄取［31］。miR-223最初被报道具有骨髓细胞特异性，后续研究发现miR-223也能通过靶向结合SR-BI抑制HDL-C摄取，同时还能直接抑制肝3-羟基-3-甲戊二酸单酰辅酶A合成酶1（3-hydroxy-3-methlglurtaryl-CoA synthase1，HMGCS1）和甲基固醇单加氧酶1（methylsterol monooxygenase 1），减少胆固醇的生物合成，重要的是miR-223反过来也受到胆固醇水平的影响，两者之间形成了一个反馈调节通路：当胆固醇水平降低时，miR-223表达受到抑制，受miR-223负向调控的胆固醇合成和摄取增加，胆固醇水平升高［32］。

总之，在miRNA调控HDL代谢这一领域取得的研究进展表明，一个复杂的miRNA调控网络能通过转录后机制调节脂蛋白代谢中多个环节所涉及的不同基因，最终共同协调完成HDL的代谢过程。

3 miRNA调控LDL和VLDL代谢

目前对miRNA调控HDL代谢的机制研究逐渐深入，而miRNA在LDL和VLDL代谢过程中的作用尚未明确。早期研究发现在小鼠和灵长类动物肝脏内，miR-122能调节血浆LDL-C和VLDL-C水平［33］，然而沉默miR-122在降低血浆LDL-C的同时，也会给小鼠带来肝脂肪变性等有害影响［34］，极大降低了临床运用miR-122抑制剂治疗血脂异常的可能性。

最近研究发现一些miRNAs如miR-148a和miR-128-1能够参与VLDL的分泌、胆固醇的生物合成和肝LDL受体（LDLR）表达等代谢过程，从而调节血浆LDL-C和VLDL-C水平。GOEDEKE等［27］用人类全基因组关联研究（GWAS）和高通量的基因筛选法发现了LDL-C和VLDL-C代谢的两个重要调节因子：miR-148a和miR-128-1。人类miRNA表达数量性状位点分析显示miR-148a启动子区的单核苷酸多态性（SNP）与总胆固醇（TC）、LDL-C和TG水平变化密切相关。miR-148a除了能够直接结合LDLR的3′-UTR端，还能结合涉及脂质代谢的其他一些基因，如ABCA1、PGC-1α、AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）等，因此在apoE-/-小鼠体内沉默miR-148a会降低LDL-C水平和升高血浆HDL-C水平。miR-128包括两种亚型miR-128-1和miR-128-2，两者均可生成成熟的miR-128基因。研究表明miR-128-1在调节胆固醇、脂质代谢和能量平衡中起着关键的作用，和miR-148a相似，miR-128-1也能通过直接靶向结合LDLR和ABCA1来调控脂代谢［24］，在apoE-/-小鼠中长期抑制miR-128-1会引起LDL-C、VLDL-C和TG显著下降，肝脏脂肪变性程度减轻。这些研究结果显示，抑制miR-148和miR-128-1也许可以用于治疗血脂异常、肥胖和动脉粥样硬化等代谢性疾病。进一步的研究应在其他动物模型上验证抑制miRNA介导LDL和VLDL代谢的作用机制，并探讨长期沉默miRNA对机体是否产生有害影响。

也有研究已经证实miR-30c与TC、TG和VLDL的生物合成水平有关，通过靶向抑制微粒体转移蛋白（microsomal transfer protein MTP）而减少VLDL-C的合成［35］。除此之外，miR-30c还能够结合溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1（lysophosphatidyl glycerol acyltransferase 1，LPGAT1）来抑制肝脏磷脂合成。体内运用慢病毒或miRNA模拟物在肝脏过表达miR-30c，能降低LDL-C和VLDL-C水平，减轻高脂血症并改善apoE-/-小鼠动脉粥样硬化的症状，相反，在apoE-/-小鼠体内抑制miR-30c水平则升高血浆LDL-C和VLDL-C水平，并促进动脉粥样硬化形成。值得注意的是，miR-30c抑制VLDL的生成的同时也能抑制肝脏脂质合成，因此不会造成肝细胞脂肪变性，提示体内过表达miR-30c可能是治疗高胆固醇血症的有效方法［36］。

4 miRNA与非酒精性脂肪性肝炎

肝脏是机体的脂代谢中枢，能够维持全身TG的代谢稳态。从食物中摄取的脂肪进入血液循环，其中TG在外周组织被水解，释放出游离脂肪酸运送到肝脏，肝脏通过脂肪酸的从头合成途径生成TG，以VLDL的形式释放入血。一旦机体出现脂质代谢紊乱，过多的TG积聚在肝细胞会引起肝细胞脂肪变性，形成非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD），而长期的脂肪积累同时也会引起肝脏的炎症反应，进而出现非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）［37］。

目前已有研究证实NAFLD患者和NASH患者体内均出现了miRNA差异表达［38］，其中变化显著的miR-122调控胆固醇代谢的机制最为复杂。CHEUNG等［39］发现在NASH患者的肝脏内，miR-122的显著降低与肝脏脂代谢紊乱及NASH的发生发展密切相关。GAO等［40］的研究显示miR-122能上调胆固醇合成限速酶3-羟基-3-甲基戊二醛单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR），促进胆固醇和TG的合成，也能通过对丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白-6（hepatitis C virus core-binding protein 6，HCBP6）的靶向调控作用而增加肝脏TG沉积。最近的一项研究发现在高脂饲喂的大鼠肝脏内抑制内源性miR-122表达，大鼠体内脂肪颗粒变性明显得到改善，肝脏中TG含量减少，脂肪肝发病率降低［41］。这些研究提示miR-122可以作为治疗NASH的潜在靶点来改善肝脏的脂肪变性。与单纯的脂肪肝病人相比，miR-21水平在NASH病人肝脏内明显上调［42］，研究者给LDLR敲除（LDLR-/-）小鼠喂食高脂肪饮食，小鼠随后表现出急性肝脏炎症，在这些模拟NASH的小鼠肝脏内miR-21水平明显升高，抑制miR-21后肝脏炎症和肝纤维化程度减轻，说明miR-21在脂肪变性引起的肝脏炎症反应中发挥着重要作用，该研究还提出PPAR-α可能是miR-21作用的靶标，但miR-21在NASH形成过程中的具体调控机制还有待进一步确定。

在NAFLD和NASH患者肝脏内异常表达的miRNA中，miR-34a升高较为明显［39］。LEE等［43］发现饲食引起肥胖的小鼠和瘦素基因缺陷引起肥胖的小鼠（ob/ob小鼠）均会形成脂肪肝，进一步实验显示这两种肥胖模型小鼠的肝脏内均有miR-34a水平升高和SIRT1水平下降。SIRT1是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的组蛋白脱乙酰酶，能够通过去乙酰化肝脏中的组蛋白和一些重要的转录因子如PGC-1α、PPARs、p53、LXR、FXR和SREBPs，而广泛参与了肝脏的脂代谢。KEMPER等［44］在研究中发现miR-34a、SIRT1、p53和FXR构成了一个调节脂类稳态的双向通路：miR-34a抑制SIRT1。SIRT1首先去乙酰化和失活p53，p53是miR-34a的转录激活物，p53失活将降低miR-34a水平；同时SIRT1还可以去乙酰化FXR，后者激活肝阻遏子（small heterodimer partner，SHP），阻隔p53结合miR-34a启动子，因而再次降低miR-34a水平。根据以上研究结果推测：miR-34a负向调控SIRT1进而通过影响SIRT1下游的一些关键代谢靶标来促进脂肪肝形成，而抑制miR-34a，激活SIRT1有可能是治疗NAFLD和NASH的另一种方法。生物信息学研究证实SIRT1也是miR-146b的作用靶点，然而和miR-34a对脂肪肝作用效应相反，miR-146b通过调节SIRT1水平能够抑制脂肪肝形成。AHN等［45］通过体外培养小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1细胞）发现在脂肪细胞成熟过程中miR-146b水平上调，如果在细胞内过表达miR-146b则诱导3T3-L1细胞分化；相反在小鼠体内应用miR-146b抑制剂可促使SIRT1水平升高，降低小鼠体重和脂肪含量。

5 miRNA与肥胖

在人类脂肪组织中存在大量miRNA，参与了诸多与肥胖有关的生物过程，如脂肪细胞的分化、局部炎症反应以及胰岛素抵抗、脂肪代谢等［46］。LEE等［47］发现有大约100种miRNAs在人前体脂肪细胞分化成熟过程中发生了表达改变，如miR-204、miR-141、miR-200a-c、miR-429都参与了早期脂肪细胞的命运决定，另一些miRNAs如miR-130，miR-27和miR-378/378*参与了脂肪细胞的终末分化［48-49］。miR-143是首个被发现的参与脂肪分化的miRNA，并能同时在两种细胞系（3T3-L1前体脂肪细胞和人前体脂肪细胞）诱导分化的过程中出现差异表达。miR-143在白色脂肪细胞的终末分化阶段水平升高，通过MAPKK5-MAPK7通路促进脂肪细胞的分化［46］，但在BMI＞30 kg/㎡的肥胖患者皮下脂肪组织中表达水平却显著下调［50］，进一步的研究表明脂肪组织中的炎症状态、游离脂肪酸、抵抗素和瘦素都可能导致miR-143水平减低［51］。

哺乳动物主要有两种脂肪，白色脂肪组织用来储存额外的能量，棕色脂肪组织燃烧脂肪来产生热量，具有高代谢活性，miRNA是白色脂肪组织和棕色脂肪组织代谢过程的关键调节因子，在不同的脂肪组织中表达水平与调节模式截然不同［52］。SUN等［53］在研究中确定了一个棕色脂肪富集的miRNA簇：miR-193b-365，在脂肪形成过程中miR-193b-365能诱导成肌细胞分化成棕色脂肪细胞。LIN等［54］发现当敲除小鼠附睾白色脂肪组织中的RNA结合蛋白KSRP后，miR-145水平降低，脂肪分解作用反而增强。研究显示，miR-145能直接作用于转录因子FOXO1和脂肪分解过程的激活剂Cgi58来抑制脂肪分解过程。另一项关于miR-378/378*的研究表明，小鼠体内沉默miR-378和miR-378*能够增强线粒体脂肪酸代谢和升高胰岛素靶组织的氧化能力，抵抗高脂饮食诱导的肥胖［55］。上述研究同样提示靶向特异性miRNA的方法可能有助于治疗肥胖症。

6 结语

近年来，许多研究表明，miRNAs在调节脂质代谢和代谢紊乱性疾病中发挥着重要作用。笔者介绍了与miRNA介导HDL、LDL和VLDL代谢机制以及miRNA在NASH和肥胖症发生过程中的调节作用密切相关的研究进展，提示针对miRNA的靶向调控机制也许可以作为治疗代谢紊乱性疾病的一种新方法。然而也有少量研究显示长期抑制一些miRNAs（如miR-122、miR-33）会对机体带来血脂异常、肥胖、脂肪肝等不良影响。因此，进一步探讨miRNA调控脂代谢的机制，明确miRNA的作用靶点，对研究脂代谢紊乱性疾病的发病机制以及药物干预治疗具有重要意义。

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