SERCA2a在糖尿病心肌病中表达与调控研究进展

贾 昊 刘云鹏 屈欣怡 刘仲伟 姜 馨

1.SERCA2a生物学特性及病理生理学作用

SERCA是一种分子量为110 kDa的跨膜蛋白，属于P型ATP酶家族，可以分为3个不同区域的跨膜蛋白，包括胞浆区、跨膜螺旋和管腔袢，并且有10多种不同的细胞亚型在不同组织中表达。在心脏，其主要表达为SERCA2a，它能够利用ATP水解得到的化学能源运输2个Ca2+离子进入肌浆网内。SERCA2a的活性取决于SERCA2a蛋白的含量，并进一步受其抑制蛋白受磷蛋白(phospholamban，PLB)、肌脂蛋白(Sarcolipin，SLN)的调控[1]。SERCA2a是心脏收缩舒张调节的主要决定因素，已被证实降低该蛋白的表达会导致心脏收缩、舒张功能障碍。

SERCA2a对于维持钙稳态，促进心肌细胞正常活动是非常重要的。心肌细胞内肌浆网钙吸收不足，意味着细胞收缩可用的钙量减少，最终导致心脏收缩和舒张功能受损。在许多心血管疾病如糖尿病心肌病、心力衰竭中发现这一钙稳态失衡，潜在的机制可能是由于多种因素导致的SERCA2a mRNA、SERCA2a蛋白的表达或活性降低。众多研究表明在糖尿病心肌病大鼠中SERCA2a的表达明显下调，钙摄取量明显减少[2]。同时，钙超载可诱发心律失常，致使SERCA2a活性降低，胞质内Ca2+水平升高，最终导致钠钙离子交换体蛋白(Na+/Ca2+exchanger,NCX)表达增加，这将使阿诺碱受体(ryanodine receptor，RyR)开放进一步增加，在心脏舒张期增加钙漏，诱发后除极和触发活动，进而引起室性心律失常。Wang等对心力衰竭动物模型的研究显示，在肥大的心肌细胞中，PAK1缺陷增加了快速心律失常的易感性，进一步研究得知，PAK1通过调整SERCA2a的活性来维持钙稳态和细胞电生理稳定[3]。随着SERCA2a活性的下降，心肌细胞胞浆内钙离子浓度升高，其电稳定性下降，从而易于发生室性心律失常。最近的研究也表明，SERCA2a基因治疗可以改善心脏收缩功能并且恢复细胞电生理稳定性，从而起到抗心律失常的作用。总之，在糖尿病心肌病等心血管疾病中，SERCA2a活性降低是导致糖尿病心肌病患者心功能障碍、心律失常的重要原因之一。

2.PLB、SLN对SERCA2a的调控

(1)PLB对SERCA2a的调控 PLB 是由52个氨基酸组成，位于心脏肌浆网上。PLB在身体各组织中表达含量不同。例如，PLB在小鼠心室组织比心房组织表达高3倍以上，在心脏活动的各个时期中需要对Ca2+进行不同的调节。这在人类心脏组织中也得到了证实，PLB蛋白在右心房组织较右心室减少44%，其去磷酸化作用抑制SERCA2a的活性。当细胞内Ca2+浓度低时，PLB干扰SERCA2a，减弱SERCA泵对Ca2+的表观亲和力。当Ca2+浓度增高时，由于Ca2+的激活，这种抑制作用得到缓解。PLB受到钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的调控。CaMKII是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在SERCA2a的苏氨酸[17]残基上活化使PLB磷酸化。另一个PLB调控机制是PKA的激活。PKA激活是在SERCA2a的丝氨酸[16]残基上将PLB磷酸化，进而缓解对SERCA2a抑制，提高心肌收缩和舒张的速度。通过PKA或CAMKII途径使PLB磷酸化可使SERCA2a活性提高2～3倍[4]，这将有利于增加心肌舒张速度。因此，增加总PLB蛋白质含量或PLB磷酸化是调节心脏SERCA2a活性的途径之一。

(2)SLN对SERCA2a的调控 SLN与PLB同属一蛋白家族，其作用与PLB类似，具有一个保守的跨膜结构域，通过直接结合或与PLB形成二聚体后结合SERCA2a，调节钙离子敏感性。SLN在心房组织中高表达，心室只有少量表达。在结构上，SLN是一个具有31个氨基酸的蛋白质，其抑制心脏SERCA2a的活性，可能通过降低泵的表观亲和力导致细胞内钙稳态失衡。Babu等用腺病毒将SLN基因转染到大鼠体内，发现大鼠心肌细胞内钙瞬态幅度降低，SLN对SERCA2a功能的抑制作用减少了31%，证实其可以减缓心肌细胞舒张作用[5]。类似于PLB，SLN在SERCA2a的苏氨酸5残基上将丝氨酸/苏氨酸激酶16(STK16)磷酸化，促进SLN 与SERCA2a解离[6]。Babu等进一步研究得知，从PLB-/-转基因小鼠模型中发现，在给予异丙肾上腺素后，SLN的抑制作用得到缓解[5]，这也就是说，激动β肾上腺素能受体，可使SLN与SERCA2a解离，增强SERCA2a活性，促进心肌收缩。在心血管疾病中也已证实，SLN表达失调。比如，在二尖瓣关闭不全手术患者的左心室组织中，SLN mRNA和蛋白水平高出12-16倍[1]。综上可以得出，SLN负性调节SERCA2a活性，进而影响心功能。

3.翻译后修饰、转录因子对肌浆网钙泵的表达与调控

(1)转录因子对SERCA2a的影响 编码人类SERCA基因的是ATP2A2，位于染色体区12q23-q24.1[1]，其包括22个外显子。ATP2A2基因选择性剪接可以转录成不同的蛋白异构体，SERCA2a，SERCA2b和SERCA2c。有几个转录因子结合到ATP2A2 启动子区域调节其转录活性，分别是线粒体转录因子(TFAM)、B2(TFB2M)和转录因子Sp1。在生理情况下，已被证实ATP2A2可调节心脏SERCA2a基因转录，分别结合到启动子区-114bp至122bp 和-122bp至-117bp[7]。过度表达TFAM和TFB2M已被证明增加其转录活性的2倍。在病理情况下，特别是在糖尿病心肌病、心肌梗死和心力衰竭中，TFAM表达下调。因此，转录因子TFAM和TFB2M是调节ATP2A2基因转录过程中必不可少的影响因素之一。

另一种转录因子Sp1也可调节ATP2A2基因转录。Sp1对于心肌特异性转录位点已被证明在SERCA2a基因近端 (-284～-80 bp)启动子区。然而，Sp1调节ATP2A2基因转录的确切作用尚不十分明确，但SP1介导的ATP2A2基因转录可能是SERCA2a在糖尿病心肌病中下调的原因之一。因此，上述转录因子的异常表达，解释了糖尿病心肌病中SERCA2a活性降低的机制。

(2)翻译后修饰对SERCA2a的影响 内源性蛋白PLB和SLN磷酸化间接调节SERCA2a活性，同时一些翻译后修饰直接调节SERCA2a蛋白。这些翻译后修饰包括糖基化修饰、硝化和泛素化，可以直接调节SERCA2a蛋白[1]。

糖基化是一种翻译后修饰，发生在糖附着到SERCA2a蛋白上。糖基化已被证明降低SERCA2a活性，从而降低心肌收缩后Ca2+的回摄。糖基化水平增加，SERCA2a mRNA和蛋白水平减少25%～47%，同时PLB蛋白水平增加40%[8]。氧连接的氮乙酰葡萄糖胺修饰(O-GlcNAc)，是一种特殊形式的糖基化，它能减弱SERCA2a蛋白水平，进而影响Ca2+转运。Bennett等研究显示，在糖尿病条件下O-GlcNAc水平增加，而SERCA2a蛋白水平下降25%-47%，这将延长43%新生大鼠心肌细胞Ca2+舒张[9]，这一数据表明，O-GlcNAc调节心肌SERCA2a表达。除了SERCA2a蛋白水平改变，O-GlcNAc还可以通过调节PLB磷酸化修饰SERCA2a活性。通过腺病毒转染O-GlycNAc酶使细胞O-GlcNAc表达减少，发现PLB总蛋白含量减少50%，同时PLB磷酸化增加了2倍[9]。总的来说，这些数据表明，糖基化修饰通过直接影响SERCA2a或诱导PLB磷酸化，从而影响心脏的SERCA2a修饰调节[10]。

硝化亦被证实在人类心力衰竭中表达增加。此外，在扩张性心肌病中SERCA2a硝化水平升高约2倍左右；用高葡萄糖灌注大鼠心脏与正常血糖水平比较，SERCA2a的硝基酪氨酸水平几乎翻了一倍。Lokuta等进一步研究证实SERCA2a蛋白硝化是通过多元醇通路，主要因为高血糖条件下引起的氧化应激所致[11]。

SERCA2a泛素化目前还在研究中。泛素化修饰SERCA2a主要通过1型小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-likemodifier，SUMO1)，结合在SERCA2a 赖氨酸480和赖氨酸585残基。当心脏衰竭时，总SUMO1减少30%～40%，相应的SERCA2a泛素化也减少[12]。而在压力超负荷心脏组织中注射 SUMO1可提高心功能及SERCA2a活性。这些数据表明泛素化可能对心脏起保护作用。Kho等研究发现，下调SUMO1导致SERCA2a蛋白水平降低40%[13]。SERCA2a泛素化可以提高SERCA2a功能的具体机制仍尚未完全阐明，可能通过阻断其他的翻译后修饰，比如：乙酰化作用或提高ATP酶的活性来提高SERCA2a的功能。

4.糖尿病心肌病中肌浆网钙泵的表达与调控

(1)高血糖对SERCA2a影响 高血糖最终引起心脏病理变化为心肌肥厚、纤维化、心脏自主神经病变和心功能、结构的改变[14]。基于这些病理改变，发现在糖尿病心脏组织中SERCA2a下调。然而，这种下调的分子机制是不明确的。高血糖是糖尿病并发症进展的主要因素，其引起的心肌功能障碍包括直接葡萄糖毒性、扰乱能量代谢和细胞内Ca2+稳态失衡。目前认为，氧化应激导致的多元醇活化，糖化蛋白质导致晚期糖基化终产物AGEs(advanced glycationend products, AGEs)的形成可能通过调控SERCA2a活性，最终导致糖尿病并发症的发生[14]。

对于糖尿病引起的SERCA2a表达下调，Bidasee等首次提出在慢性糖尿病中，AGEs在SERCA2a上形成，致使SERCA2a活性降低[8]。用链脲霉素诱导的糖尿病大鼠(8周)的心脏组织，显示出较低水平SERCA2a和较高水平的PLB，并且发现AGEs与SERCA2a交联。此外，高血糖使ROS(reactive oxygen species,ROS)产生增多，激活ADP-核糖聚合酶1，这种酶抑制甘油醛3-磷酸脱氢酶，导致糖酵解中间体积累，AGEs生成，进而使SERCA2a糖基化。研究还显示，糖尿病大鼠(6周)开始使用胰岛素治疗2周后不仅可以显著改善心功能，并且还可以防止AGEs在SERCA2a上形成交联。除了SERCA2a的表达减少外，PLB的增加和SERCA2a-PLB比例降低，心脏舒张间期延长也可能是由于AGEs形成[8]。

多元醇途径可能通过增加氧化应激而损害SERCA2a活性[15]。正常血糖水平时，由于醛糖还原酶(aldose reductase,AR)，即多元醇途径的限速酶，对葡萄糖具有非常高的K m，因此该代谢途径不是非常活跃的。然而，在高血糖时，AR将葡萄糖还原为山梨醇，同时其辅助因子NADPH被氧化形成NADP。然后将山梨糖醇通过山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)转化为果糖，伴随NAD+还原为NADH[16]。NADPH的降低导致还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)水平降低，因为NADPH是谷胱甘肽还原酶再生为GSH的辅酶。另一方面，NADH水平升高会增加超氧化物的含量，因此，在高血糖时，通过激活多元醇途径降低抗氧化防御，并且增加活性氧(ROS)水平，最终导致氧化应激。以前的研究结果表明，糖尿病小鼠心脏AR的活性升高，AR抑制剂治疗改善了糖尿病大鼠心脏乳头肌的收缩能力，但机制尚不明确。Tang等研究发现多元醇途径通过降低SERCA2的活性，致使急性高葡萄糖诱导的心脏收缩功能障碍[15]。在急性高血糖心脏中，由于SDH将山梨糖醇氧化成果糖，多元醇途径的活化增加了NADH / NAD+的比例。增加的NADH刺激NADH氧化酶，以产生ROS。ROS通过氧化半胱氨酸硫醇来抑制SERCA2a，干扰ATP结合位点，使其不能水解ATP[17]。Tang等研究还表明，高糖灌注导致SERCA2a的硝化增加、SERCAC674-SO3H水平升高，此外，将AR抑制剂或SDH抑制剂添加到高葡萄糖灌注液中降低了SERC2a硝化和SERCAC674-SO3H的水平，这些证据表明SERCA2a活性的降低是由于高糖诱导的氧化应激引起的。总之，多元醇途径是高糖诱导氧化应激的主要原因。

(2)胰岛素抵抗对SERCA2a影响 2型糖尿病心肌细胞中SERCA2a的病理生理变化尚不完全清楚。饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠表现出SERCA2a活性降低，心肌功能障碍。然而，这并没有影响NCX功能，也没有影响SERCA2a蛋白、PLB或NCX含量[14]。最近的一项研究显示，给予2型糖尿病大鼠胰岛素治疗，早期SERCA2a / PLB比值升高，心肌细胞舒张速度增快，说明胰岛素直接刺激心肌细胞SERCA2a表达[16]。这也就是说，胰岛素和SERCA2a在2型糖尿病心脏收缩舒张过程中的重要作用。这个研究同时也发现，胰岛素可诱导Akt(v-Akt Murine Thymoma Viral Oncogene)磷酸化，表明给予胰岛素治疗后SERCA2a水平升高可能通过PI3-kinase-Akt-SERCA2a 信号通路[18-19]。此外，内质网应激也起到重要作用。Takada等用OLETF(自发2型糖尿病)大鼠模型，培养25-30周，发现心肌细胞中内质网应激标志物GRP78和GRP94水平增加，而SERCA2a蛋白(但不是mRNA)减少(35%)[20]。进一步研究发现，与无糖尿病大鼠(LETO)相比，SERCA2a泛素化水平升高，证明内质网应激介导SERCA2a泛素化增强，致使SERCA2a蛋白的表达下调，进而引起心脏舒张功能不全。但是，众多研究表明糖尿病大鼠中SERCA2a mRNA水平减少，而以上研究模型却没有。对这一研究结果一个合理的解释是，在SERCA2a基因转录降低之前，SERCA2a蛋白减少可能通过一些非转录机制，比如上述提到的翻译后修饰，使SERCA2a降低，并且SERCA2a基因转录导致SERCA2a mRNA降低是糖尿病晚期事件。总之，在2型糖尿病中，胰岛素通过直接刺激SERCA2a、胰岛素抵抗内质网应激调控SERCA2a蛋白的表达。

5.小结与展望 众多实验表明，SERCA2a在糖尿病心肌病发生发展中起重要作用。高糖、胰岛素抵抗引起的心脏收缩舒张功能障碍可能与多元醇的活化，AGEs的形成，氧化应激、内质网应激的增加有关，上述因素通过降低SERCA2a活性或SERCA2a蛋白含量，导致SR钙回摄减少，引起心肌舒张速度降低。此外，转录因子TFAM、TFB2M、SP1均可结合到ATP2A2 启动子区域来调节SERCA2a转录活性，非转录途径通过几种翻译后修饰对SERCA2a蛋白调控，致使SERCA2a活性下降。我们仍不知道是否有其他途径参与SERCA2a的调控，对于糖尿病心肌病中SERCA2a表达与调控仍需进行更深层次的探索。SERCA2a表达与调控可能是糖尿病心肌病心力衰竭防治新的靶点。