红细胞血型基因分型在精准输血医学中的应用

(Tongmao ZHAO)

(美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，USA)，20892)

1900年人类ABO血型的发现开创了免疫血液学(Immunohematology)，它成为现代输血医学的基础之一。在20世纪前半期，免疫血液学主要采用免疫血清学、生物化学以及经典遗传学等方法，检测红细胞表面的血型抗原和抗体。 20世纪90年代，随着分子生物学技术扩展到整个生物医学研究领域，分子免疫血液学 (Molecular Immunohematology) 应运而生，它主要研究血型抗原和基因多态性的分子基础。21世纪初生物医学领域进入了后基因组时代，相应产生了一门新的血型基因组学 (Blood Group Genomics) 学科，并建立了以DNA为基础的血型基因分型技术，它在精准输血医学(precision transfusion medicine)中扮演着重要角色。本文主要论述了血型基因分型在实际应用中的一些最新研究进展。

1 红细胞血型抗原和基因

截止2017年被国际输血协会(ISBT)认可的总数为346个，其中308个分属36个血型系统，其余38个抗原尚未被归类。几乎所有具有临床意义的血型系统的分子基础已被阐明[1]。根据美国国家生物技术中心(NCBI)的血型基因突变数据库(Blood Group antigen gene Mutation Database，BGMUT)统计，目前已经检测出45个血型基因，含有1 800多个等位基因[2]。已阐明的血型遗传多态性产生机制包括单核苷酸取代(SNP)、基因缺失或插入、基因不等交换、剪接位点突变、基因重组和杂交基因等[3]。

2 精准医学时代的分子免疫血液学

精准医学的基本概念是考虑到个体差异后所实施的预防诊断和治疗策略，2011年美国科学院即提出要走向精准医学、建立生物医学研究的知识网络和新的疾病分类学。美国奥巴马总统在2015年的国情咨文中呼吁以精准医学方法改善医疗服务。美国国立卫生研究院(NIH)现任院长COLLINS在“精准医学新举措”一文中提出，输血中的血液分型是精准医学的首例应用之一[4]。2015年9月10日在NIH举办了“2015年精准医学红细胞基因分型”研讨会，讨论了分子免疫血液学的进展和如何改变对患者的护理，通过病例报告说明患者护理策略；回顾了分子分型基础研究及其在临床实践中意义；探讨了红细胞基因分型防止同种免疫的策略以及红细胞基因分型在精准输血医学中的未来发展[5]。

目前分子免疫血液学检测在全球变得越来越普遍，血型工作者都认可任何单独血型血清学方法都不能满足临床输血的实际需要，唯有结合更个性化的基因检测方法才能使患者受益。基因分型作为辅助技术有助提高红细胞定型准确性，而且可以检测血清学方法无法鉴定的血型基因多态性。2015年美国血库协会(AABB)分子免疫血液学圆桌会议讨论了在血型检测领域具有挑战性和争议性的一些议题，会议认为虽然血清学仍然是在紧急情况下的唯一实用方法，但是分子检测是解决复杂问题的黄金标准，包括血型抗原的疑似变异体、表型被最近输血掩盖、直接抗球蛋白试验阳性的样品等。会议预期如果分子技术变得更简便易行、检测时间更快、费用更低，那么将来某些血型系统的基因分型可能会替代血清学分型[6]。

在血型基因检测技术兴起的同时，美国AABB于2008年率先推出“红细胞、血小板、中性粒细胞抗原分子检测标准”，在2016年已经更新到第3版[7]。此外，AABB还举办一系列研讨会，为这日益成熟技术的应用提供了深入探讨的平台，发挥监管和倡导作用，为创新铺平道路，并通过其教育措施和出版物来传播尖端研究结果。美国食品药品监督管理局(FDA)生物制品评估和研究中心(CBER)，作为评估和验证机构也开始为红细胞基因分型制定相关法规，制备用于评估基因分型技术和试剂的DNA参考品[8]。参考品将包括AABB推荐的约90种血型基因型，捐赠者红细胞将冷冻保存用于血清学分型，同时通过EB病毒转化来建立淋巴母细胞样细胞株，通过细胞培养制备的基因组DNA也将通过国际合作等形式得到确认。由于血型分布与人种以及种族群体相关，中国也在建立适合本国人群的血型基因标准DNA配组[9]。

3 血型基因分型用于检测患者血型

3.1 直接抗球蛋白试验阳性和红细胞多凝集作用患者

患者红细胞与IgG抗体结合，在直接抗球蛋白试验中呈阳性反应。虽然采用诸如二磷酸氯喹或EDTA-甘氨酸(EGA)处理红细胞的方法可以去除IgG，但并非总是成功的。具有多凝集作用红细胞的血型鉴定，通常都会遇到麻烦，在这些情况下基因分型可以预测患者红细胞表型。

3.2 最近输血患者

对于最近输血的患者，获得准确的表型有时是不可能完成的任务。尝试将输入的供者红细胞与患者红细胞分开通常不会成功，因此患者最可能的表型一般是通过最佳猜测方法得出。但是DNA分型可以用来准确预测患者的表型，而且输入的供体白细胞不影响分型结果。

3.3 鉴定ABO血型疑难样品

这些样品包括ABO血型正反定型结果矛盾，ABO不匹配的造血干细胞移植、大量输注外来血液、冷自身抗体、急性骨髓性白血病以及免疫缺陷病导致ABO抗原性减弱等。所有这些定型疑难样品，都可以通过基因分型解决。参加2015年AABB分子免疫血液学圆桌会议的34%(18/53)与会者表示曾利用基因分型帮助患者进行ABO定型，通常可以解决或确认血清学所怀疑的A或B抗原变异体问题[6]。

3.4 鉴别弱D抗原和RhD阴性

D抗原具有临床意义，在基因水平上定义了许多D变异体。从临床角度来看，特别重要的是区分弱D与部分D表型。部分D表型个体可以产生抗D同种抗体，而弱D表型个体不能。某些D抗原变异体的D抗原性非常弱，使用血清学方法难以确认，容易被误定型为RhD阴性。比如常见于亚洲人中的RhDEL型，常被误定为RhD阴性，因此需要通过基因分型鉴别是否是RhD阴性。目前已经有报告提出在临床实践中应该对血清学弱D表型患者进行RhD基因分型[10]。

3.5 选择基因型匹配供者

虽然对于大多数接受输血患者不需要基因型匹配的供者，但是对某些特定患者需要个体化处理。比如有1例镰刀型细胞贫血病患者，RH基因分型显示是Dce纯合子表型，携带2个RHCE*ce48C等位基因。该等位基因编码RHCE基因外显子1区域第16位半胱氨酸，与Dce表型相关，由于缺乏检测RHCE*ce48C表型的抗血清，患者只能接受随机供者血液，从而导致产生抗e抗体和溶血。而如果使用基因分型，选择RHCE*ce48C等位基因匹配血液输注会取得良好的效果[11]。在血清学鉴定为Dce表型的中国人中，大约有1/3的个体携带有RHCE*ce48C等位基因，因此遇到输血产生抗体和溶血的患者应该考虑此等位基因是否匹配。

3.6 无效型鉴定

无效型个体比较少见，通常是在患者已经产生抗体后才被发现，这些抗体一般对应高频率抗原。现在可以在输血前对患者做无效型基因检测，确认患者是否是无效型，以避免输血后产生抗体。

3.7 协助解决复杂的抗体检测

由于多种原因可能使鉴定血型抗体变得复杂，如受检血清含有同种抗体和自身抗体、涉及到一些高频率或低频率的抗体和弱反应的抗体、配组红细胞缺少相应抗原的抗体。使用基因分型有助于鉴定抗体。

4 血型基因分型用于预测供者血型

4.1 大规模的献血者血型基因分型

对于由于输血、妊娠、组织器官移植等同种免疫作用产生血型抗体的患者，需要输注相应抗原阴性的血液。血液中心的任务之一是提供ABO和D以外的特定抗原阴性血液。如果使用标准抗血清筛查，不仅耗时且费用昂贵，而且不一定能够获得所有的分型试剂。血液中心可以放弃血清学筛查，代之以预先对献血者红细胞基因进行分型，并整合到血液供应链中，以满足临床对抗原阴性血液的需求。FLEGEL等[12]报道了43 966例献血者42个红细胞抗原基因分型结果，获得1 667 026个基因型数据，发现728 482个抗原阴性基因型。在5 672例患者中，有5 661例(99.8%)需要抗原阴性红细胞制剂，其中5 339例(95%)找到抗原阴性血液。红细胞基因分型有可能改变将来的供血方式。基因型数据易于在线查询，可以减少或避免血清学筛查，为患者提供廉价安全的抗原阴性红细胞制剂。

4.2 筛选无效型献血者

携带无效等位基因的个体，不表现相应血型抗原，接受血液输注很容易产生血型抗体，为此需要使用罕见的无效型献血者血液。筛选无效型献血者需要大量标准抗血清，在缺少相应抗血清的情况下，即可以使用DNA做基因分型[13]。

[1] STORRY J R, CASTILHO L, CHEN Q, et al. International society of blood transfusion working party on red cell immunogenetics and terminology: Report of the Seoul and London meetings[S]. ISBT Science Series, 2016, 11:118-122.

[2] The Blood Group Antigen Gene Mutation Database. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.cgi?cmd=bgmut/home[EB/OL]. 2017-05-26.

[3] 赵桐茂. 免疫血液学基础[M]. 北京：人民卫生出版社, 2017：50-72.

[4] COLLINS F, VARMUS H. A new initiative on precision me-dicine[J]. N Engl J Med, 2015,372(9):793-795.

[5] DENOMME G A, ANANI W Q, AVENT N D, et al. Red cell genotyping precision medicine:A conference summary[J]. Ther Adv Hematol, 2017,8(10):277-291.

[6] FLEGEL W A, CASTILHO L, HEATON W A, et al. Molecular immunohaematology round table discussions at the AABB Annual Meeting, Anaheim 2015[J]. Blood Transfus, 2016,14(6):557-565.

[7] The AABB Standard Program Committee. Standards for molecular testing for red cell, platelet, and neutrophil antigens[M]. 3rd.Maryland: Bethesda, 2016:7-9.

[8] LIU Z. Establishment of reference panels for blood group geno-typing tests. https://www.fda.gov/BiologicsBlood Vaccines/ScienceResearch/BiologicsResearchAreas/ucm352425.htm[EB/OL]. 2017-11-23.

[9] CHEN Y, ZHAO T. Application of a multiplex PCR genotyping assay of 31 red blood cell antigens for establishment of a panel of reference DNA in China[J]. Asia Pacific Journal of Blood Types and Genes, 2017,1(4):13-16.

[10] SANDLER S G, FLEGEL W A, WESTHOFF C M, et al. It’s time to phase in RHD genotyping for patients with a serological weak D phenotype[J]. Transfusion, 2015,55(3):680-689.

[11] LAPADAT R, MYEYER E, JOSEPHSON C. et al. Exon sequencing improves red blood cell phenotype matching in a patient homozygous for the Rhce*Ce48c allele[J]. Transfusion, 2015,55(3):152A.

[12] FLEGEL W A, GOTTSCHALL J L, DENOMME G A. Integration of red cell genotyping into the blood supply chain: A population-based study[J]. Lancet Haematol, 2015,2(7):e282.

[13] FLEGEL W A, GOTTSCHALL J L, DENOMME G A. Implementing mass-scale red cell genotyping at a blood center[J]. Transfusion, 2015,55(11):2610-2615.