嵌合抗原受体T细胞治疗原发性肝癌的研究进展

许　洋，张雅敏，王　建，刘子荣

(1.天津医科大学第一中心临床学院，天津 300070；2.天津市第一中心医院 肝胆外科，天津 300192)

原发性肝癌(简称肝癌)为比较常见的恶性肿瘤，其在癌死因中位列第2位，仅2015年全世界新发患者数约74.5万例[1]。肝癌的主要治疗手段包括手术治疗(肝切除或肝移植)、肝动脉化疗栓塞(transarterial chemoembolization,TACE)以及局部消融疗法等。尽管分子靶向等生物治疗有所进展[2]，能延长部分患者的生存期，但整体疗效有待提高。近年来，免疫治疗实体肿瘤获得了长足的进步，以嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T 细胞为代表的靶向免疫治疗的成就尤其突出[3]。其成为多种肿瘤治疗的不可或缺的手段之一，被《Science》杂志列为 2013 年10大科学突破的首位[4]，由于其在体外及临床前实验甚至临床试验中表现出较好的靶向性及持久性，所以拥有着巨大的发展潜力及前景。本文将着重介绍CAR-T细胞及其对于原发性肝癌相关靶点的作用效果，以及不良反应及相关措施。

1　CAR-T细胞的原理、组成及发展

将识别肿瘤相关抗原(TAA)的单链抗体(scFv)与T 细胞活化基序在体外基因重组形成重组质粒，经过反转录病毒或慢病毒载体、转座子或转座酶系统或直接 mRNA 传导到T细胞内，并于细胞表面形成融合蛋白，使患者T细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经纯化和大批扩增后的T细胞，称为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。肿瘤抗原单克隆抗体的可变区与T细胞受体(TCR)的亚基嵌合在一起，此种T细胞既具备抗体的特异性，以非主要组织相容复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制性的方法识别特定抗原，并且能有效的使T细胞活化，加强其识别和杀伤肿瘤的能力[5]。

CAR-T细胞由胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区构成。胞外抗原结合区主要是单克隆抗体的单链可变区序列，或激素的信号肽、细胞因子和膜受体的胞外区等，与传统TCR不同，其可直接识别抗原，不需要对抗原肽-MHC复合物形式进行识别，并且蛋白质类及糖脂类均能被识别[6]。CAR发挥作用依赖铰链区的大小、灵活性和活动范围，灵活的铰链区对于CAR-T细胞识别抗原是必要的。跨膜区在T细胞活化及CAR二聚化起着关键作用，含有CD3跨膜区的 CAR对于T细胞激活作用较其他膜分子的跨膜区要明显很多[7]。胞内信号区为T细胞受体TCR/ CD3ζ链或免疫球蛋白 Fc受体 FcεRIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs)，可发挥信号传导功能。

目前CAR的发展历经了4代：第1代CAR主要由scFv及单一信号分子(如CD3的ζ链)组成，其只能识别靶抗原并激活T细胞，由于不存在共刺激分子，T细胞只可进行短暂分裂及较低水平的细胞因子的分泌，其杀瘤作用持续性及杀伤性较弱。第2代CAR增加了共刺激信号域，将共刺激分子(如 CD28、4-1BB等)的胞内域重组到基本骨架中，实现了共刺激分子和细胞内信号的双重活化，使 T 细胞持续增殖裂解并高水平的细胞因子分泌，提高 T 细胞的杀瘤能力。第3代CAR则增加2个以上的共刺激分子，使T细胞的细胞毒性、增殖活性、存活时间和细胞因子释放等均有显著提高，但靶向识别能力降低，可产生细胞因子风暴[8]。第 4 代 CAR(又称 TRUCKs)，在第3代CAR的基础上增加了编码 CAR和/ 或其反应性启动子的载体，在转基因产生的细胞因子作用下 CAR 产生有效信号并招募免疫系统其他成员，增强抗肿瘤免疫效应。

CAR-T技术的关键点在于肿瘤相关靶点的选择。靶点选择优先考虑正常组织中不表达或表达很少的肿瘤特异性抗原(TSA)，但由于当前肿瘤特异性抗原的发现较少，故目前应用于CAR-T的靶点为正常细胞表达较少，而在肿瘤细胞增殖时高度表达的肿瘤相关抗原(TAA)。当前的治疗通过将抗原特异性人单克隆抗体或设计人源化或嵌合单克隆抗体分离，以此来靶向攻击肿瘤相关抗原，如利妥昔单抗(CD20)对于淋巴瘤，曲妥单抗(HER2/NEU)对于乳腺癌等，所以对于原发性肝癌相关的靶点的选择至关重要。

2　原发性肝癌相关靶点

利用免疫方法治疗原发性肝癌经过多年测试，运用细胞因子或单克隆抗体的方法，大多数已证实其能成功使肿瘤发生特异性免疫反应并且安全有效，但并不能反映确切的临床效果[9]。在基于T细胞的免疫疗法的成功开发之前，需进行免疫反应的TAA的鉴定与筛选。

2.1　磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)

GPC3 作为一种跨膜糖蛋白，其在细胞的增殖、分化乃至转移中起到重要作用。GPC3在 HCC中呈特异性高表达，且在初期即可检出，尤其在小肝癌及 AFP 阴性的HCC患者中阳性率很高[10]。在肝癌组织中GPC3水平明显升高，以GPC3为肿瘤相关抗原，构建出具有杀伤作用的CAR-GPC3-T细胞，并在小鼠肝癌模型观察其功效，发现其能有明显的抗瘤作用，并且肿瘤组织重量明显减轻[11]。GPC3是一个对HCC具有高度诊断价值的肿瘤标志物，其检测不仅利于HCC早期筛查与诊断，同样对HCC的疗效与预后判断也具较高价值。

2.2　甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)

AFP是内胚层组织来源的细胞所分泌的一种糖蛋白，其水平在小儿肝母细胞癌及成人肝细胞癌中明显升高。在60%～80%肝癌患者的血清及肿瘤组织中，AFP的水平明显升高，使其成为CAR-T细胞免疫治疗的理想靶点。 以AFP为靶抗原构建出CAR-AFP-T细胞，并在Hep G2荷瘤小鼠模型上进行验证，结果发现经血管给药，约17%的小鼠的瘤体积较对照组明显较小；经瘤内注射给药，约75%的小鼠肿瘤完全消退，并且没有瘤组织残留[12]。

2.3　CD133

肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是一种数量较少的干细胞样癌细胞亚群，是肿瘤形成的起始细胞，也是肿瘤复发、转移、放化疗抵抗乃至治疗失败的根源。CD133是肿瘤干细胞的新型标志物，在维持干细胞特性上十分重要，且与肿瘤的预后不良相关。相关Meta分析指出，CD133在肝癌病人中显著表达，且与患者的总体生存率(OS)及无瘤生存率呈负相关[13]。 利用第3代CD133-CAR-T细胞治疗恶性多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma mulfiform,GBM)有显著疗效，且在血液中能稳定存在，其在动物试验中能明显提高动物的总体生存率[14]。目前尚没有发现以此为靶点构建CAR-T细胞治疗肝癌的临床前实验，所以CD133可能作为新兴肿瘤免疫治疗的合适的靶点。

2.4　Notch1

Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，Notch信号影响细胞正常形态发生的大多数过程，包括细胞的分化、细胞凋亡及细胞边界的形成等。在乙肝病毒相关性肝癌中，乙肝病毒X蛋白(HBx)作为致癌因子，通过使Notch信号通路活化而促进肝癌的发生，而使用γ分泌酶抑制剂(GSI)阻断Notch信号通路发现其能抑制HepG2肝癌细胞的增殖，并将细胞阻滞于G0/G1期，并能诱导肝癌细胞的凋亡[15]。

在肝癌患者中，存在针对许多肿瘤抗原的自发T细胞应答，如针对NY-ESO- 1，MAGE- A10和p53等，但这些T细胞应答并不能杀灭或抑制肿瘤细胞，归其原因，可能是由于大多免疫抑制的机制是由肿瘤本身所主导。例如许多分子(如MHC)的正常免疫应答会被肿瘤本身所干扰，或是在肝癌患者中CD4 T细胞的损伤为其免疫逃避的主要机制[16]，同时，淋巴细胞群的增加、NK细胞受抑制、免疫检查点通路的上调也被证实为肝癌患者免疫应答缺失的表现[17]。

3　CAR-T治疗出现不良反应及解决措施

CAR-T细胞在对肿瘤的治疗过程中也暴露出值得关注的安全问题。

3.1CAR-T细胞在临床治疗中首要问题为“脱靶效应”

如前文所述，在分子靶抗原中，特异性肿瘤抗原很少，大多为肿瘤相关性抗原(TAA)，这些抗原在某些重要脏器表达，由此造成组织脏器损伤、自身免疫性疾病或免疫缺陷。由于肝脏组织存在碳酸酐酶-Ⅸ(carboxy-anhydrase-Ⅸ)，以此为靶点构建CAR-T细胞治疗肾转移癌时，8例患者中有4例患者肝酶升高，在对其肝脏进行穿刺活检时发现，T细胞弥漫浸润胆道，在胆管上皮细胞中碳酸酐酶-Ⅸ存在表达的现象[18]。

3.2　细胞因子风暴

CAR-T细胞在杀伤肿瘤过程当中，产生大量的细胞因子，如TNF-α、IFN-α和IL- 1等，从而引发以急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndro-me，ARDS)及多脏器功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)为主的“细胞因子风暴”[19]，在使用CAR-T细胞治疗结肠癌伴肝转移及肺转移的患者时，患者迅速出现ARDS而导致死亡[20]。

除此之外还包括移植物抗宿主病、插入突变、免疫逃避和过敏反应等等，如何解决这些问题也成为CAR-T细胞治疗的重要研究内容。

2010年美国重组DNA咨询委员会回顾了与CAR-T细胞治疗相关的不良反应并提出提高安全性的建议：1)引入自杀基因的人工调控开关，必要时通过诱导转染T细胞的凋亡而减轻对机体的毒性作用，由于自杀基因需要一段时间被激活，故自杀基因系统对慢性毒性反应较为有效。2)输注剂量由少到多，逐渐加量，在使用第一、二代CAR未出现明显毒性反应时，再使用下一代CAR，并从小剂量开始，防止速发的毒性反应。3)用2种单链抗体(scFv)构建双靶抗原 CAR，以提高肿瘤靶向性。4)使用小剂量反复输注CAR修饰中枢记忆T细胞和干细胞样记忆T细胞，以增加对肿瘤杀伤的特异性及减少对正常组织的损伤。

4　结语与展望

原发性肝癌如同大多实体性肿瘤，其细胞内信号传导为多条路径、多种因素和复杂交叉的网络系统，对其治疗靶点的寻找及针对不同靶点设计相关CAR-T细胞对于其治疗有着重要意义。CAR-T对于原发性肝癌的治疗受到更多的关注，并且在临床前期及临床试验中取得了一些成果，但是在对于实体瘤的治疗当中，仍存在着很多问题。例如如何提高CAR-T细胞迁移到实体瘤内发挥杀伤功能的能力，同时，即使CAR-T细胞迁入到实体瘤内，T细胞将面临有严重免疫抑制作用的肿瘤微环境，如何解决这些问题对于CAR-T细胞治疗原发性肝癌等实体瘤至关重要。 笔者认为，以后的研究中要致力于如何增强对抗肿瘤免疫抑制环境的能力、如何增强CAR-T细胞迁移到肿瘤部位的能力及寻找更多实体瘤的特异性靶抗原，同时也需要大量的临床前实验及多中心临床资料明确对于实体瘤治疗过程中，CAR-T细胞回输时机、次数、剂量和如何有效评估其治疗效果等，不断地减少不良反应的发生，提高患者生存质量，相信CAR-T技术将为原发性肝癌患者治疗带来新的希望。