蛇毒毒素中影响血小板功能成分的研究进展

赵 琦，孔 毅

(中国药科大学生命科学与技术学院生物制药教研室，南京 210009)

蛇毒是蛇毒腺分泌的天然毒素，成分复杂，含有多种具有不同生物活性的酶和多肽[1]，其能作用于血小板、调节血小板聚集反应的物质。本文从血小板功能的角度出发，对蛇毒毒素中发现的活性物质进行综述。

1 血小板的生理功能

血小板是血液循环系统中一类非常重要的无核细胞，其表面有众多受体，包括 GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ、GPⅥ、5-HT2A、TP、α2A、蛋白酶激活受体(PARs)、P2Y1和P2Y12等。当血管发生损伤时，血小板会从循环系统被募集到受损暴露的内皮下基质周围，von Willebrand factor(vWf)识别作用于血小板表面的糖蛋白受体GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ的GPⅠbα亚基，进而使血小板黏附到内皮下的胶原组织，其表面受体GPⅠa/Ⅱa和GPⅥ也结合胶原组织，使黏附更为牢靠[2]。黏附反应以及各种诱导剂与血小板表面受体蛋白的结合反应都可激活血小板，使得血小板发生一系列的响应，包括血小板形状改变以及各种胞质内含物的分泌。活化的血小板α-致密颗粒分泌的各种产物，如ADP、血清素、血栓烷素A2、肾上腺素、纤维蛋白原、vWf、凝血因子Ⅴ、Ⅺ、和能够维持并进一步扩大血小板的初级响应，并促进更多的血小板被募集。α-致密颗粒还会分泌多种蛋白质来参与止血和血管损伤修复过程，如血小板因子Ⅳ、β血栓球蛋白、肝素拮抗剂(PF4)等。大多血小板受体激活剂都能够诱导胞质Ca2+的动员，并通过G蛋白偶联受体发挥级联作用。整合素αⅡbβ3是血小板聚集过程中的主要受体分子，血小板的激活能够诱导其构象发生改变，使其变成高亲和力状态。纤维蛋白原、vWf以及其他具有RGD序列的蛋白分子与活化的整合素αⅡbβ3结合，促进血小板的相互作用[3]。vWf和纤维蛋白原的相互作用能够稳定血小板栓块的形成，进而激发一系列的级联信号反应最终造成不可逆的血小板聚集现象。

2 蛇毒毒素中影响血小板功能的活性成分

现已从蛇毒毒素中分离出许多具有不同功能的活性物质，并发掘出其药用价值，如注射用白眉蛇毒血凝酶是临床上常用的止血类药物[4]。蛇毒还具有强效的抗栓活性，科学家从其中提取出了许多新型蛇毒活性多肽，用于抗血栓治疗[5]，本文介绍几种从蛇毒毒素中纯化得到的具有影响血小板生理功能的活性物质。

2.1磷脂酶A2磷脂酶A2广泛存在于自然界中，根据其起源、氨基酸序列、结构特征、催化机制、生物化学特性以及功能差异可分为15个类型。它能特异性作用于生物膜磷脂的甘油骨架sn-2位置，从而催化生物膜磷脂的水解。磷脂酶A2是蛇毒毒素中的重要组成成分，在蛇类捕食和消化中发挥着重要的作用。蛇毒中的磷脂酶A2属于Ⅰ和Ⅱ型[6]。

磷脂酶A2具有多样的毒性和药理作用，包括神经毒性、肌毒性、促溶血、促炎反应、抗凝活性、细胞毒性、杀菌活性以及血小板功能调控活性等[7]。其中对血小板功能的影响至少包括3类。第一类能够诱导血小板聚集，如从Bothropsjararacussu和Agkistrodoncontortrix蛇毒中分离出的磷脂酶A2组分；第二类能够抑制血小板聚集，如从B.moojeni中分离到的BmooTX-Ⅰ、BmooPLA2，从B.jararacussu中分离到的BthA-Ⅰ-PLA2，从B.jararaca中分离到的BJ-PLA2，从B.erythromelas中分离到的BE-Ⅰ-PLA2，以及从B.pauloensis中分离到的BpPLA2-TⅪ；第三类对血小板具有双重影响，在低浓度或短潜伏时间内诱发聚集，在高浓度或经过长时间的潜伏后会产生抑制血小板聚集的作用，例如从Viperarussellii蛇毒中分离到的一种磷脂酶A2组分[8]。磷脂酶A2可以通过各种各样的作用机制来影响血小板的聚集功能，可以水解血小板膜表面的膜磷脂生成花生四烯酸以及相应的代谢产物如TXA2，从而促进血小板聚集反应[9-10]；也可以通过裂解花生四烯酸的副产物或其他的催化机制来抑制血小板的聚集[10-11]。

2.2丝氨酸蛋白酶 蛇毒丝氨酸蛋白酶(SVSPs)是蛇毒毒素中研究非常广泛的一类组分，在陆生蛇类中最为常见(包括蝰蛇科、响尾蛇科、眼镜蛇科和游蛇科)，而在海蛇类中少有发现[12]。蛇毒丝氨酸蛋白酶依靠其高活性的丝氨酸残基来发挥催化活性[13]。

蛇毒丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列与胰蛋白酶、激肽释放酶相似，并且表现出相同的活性中心与相似的催化机制。由于蛇毒丝氨酸蛋白酶活性中心外的序列存在差异性，导致作用底物的不同，表现出生物活性的差异[14]。一些SVSPs促进血小板聚集的活性机制与凝血酶类似，能够水解血小板受体表面的PARs受体，尤其是人类血小板表面的PAR1和PAR4。从B.jararaca，B.Atrox中分离得到的SVSPs PA-BJ和血清素thrombocytin组分，都是通过这样的方式发挥作用。这些SVSPs能够激活血小板内部的钙动员，促进凝血酶发挥功能。PA-BJ可以裂解PAR1受体N端区域的Arg41-Ser42位点，进而使Arg46-Asn47肽键断裂，使得配体失活[15]。与之相反，从Cerastescerastes中分离得到的bothrombin[16]则是通过与GPⅠba受体相互作用来激活血小板发挥功能。

2.3蛇毒金属蛋白酶 蛇毒金属蛋白酶(SVMPs)是蛇毒蛋白中的一类重要组成成分，发挥重要的蛋白水解和生物活性功能，含有Zn2+的蛇毒金属蛋白酶属于metzincin家族。它们的一级序列高度一致，Zn2+结合位点都含有共同的HEXGHXXGXXHD序列。由于氨基酸序列和结构域的不同，SVMPs可分为P-Ⅰ、P-Ⅱ和P-Ⅲ 3种类型[17]。其中，P-Ⅰ型的相对分子质量为20～30 kDa，包括信号肽、前肽和金属蛋白酶域3个结构域；P-Ⅱ型相对分子质量为30～60 kDa，在 P-Ⅰ型3个区域的基础上增加了去整合素域，该区域经常被转录后修饰酶切；P-Ⅲ型相对分子质量为60～110 kDa，以类去整合素域代替了去整合素域，且包含1个富半胱氨酸残基区域[18]。

SVMPs大多属于纤维蛋白原溶酶。如从B.lanceolatus中分离得到的BlaH1能水解纤维蛋白原的Aα和Bβ链，使纤维蛋白原失活，进而抑制血小板的聚集。另一些SVMPs具有1个影响血小板功能的重要区域类去整合素域。如从B.jararaca毒素中分离到的 P-Ⅲ型 SVMPs可以结合血小板表面整合素的α2亚基，裂解β1亚基，干扰整合素α2β1活性，从而产生抑制瑞斯西丁素和胶原诱导的血小板聚集活性[19]。SVMPs还可以通过与血小板表面其他受体相互作用从而发挥活性。如从Trimeresurusalbolabris分离到的SVMPs组分Alborhagin通过与GPⅥ受体相互作用来激活血小板功能[20]。

2.4去整合素 去整合素是一类富含半胱氨酸残基的短肽(40～100 aa)，可分为5类：①具有41～51个氨基酸残基，4对二硫键的短链去整合素；②具有70个氨基酸残基，6对二硫键的中链去整合素；③具有接近84个氨基酸残基，7对二硫键的长链去整合素；④从P-Ⅲ型 SVMPs中衍生出的类去整合素域，具有将近100个氨基酸残基和8对二硫键；⑤双链去整合素，包括同双链和异双链整合素2类，每条链具有67个氨基酸残基和10个半胱氨酸残基，形成4对链内二硫键和2对链间二硫键[8]。

去整合素都含有1个抑制环，包含 RGD序列或MLD、MGD、VGD、KGD、WGD RTS以及KTS序列。去整合素能够通过这些序列与相应的整合素结合来发挥生理活性，即能够抑制整合素介导的活性功能。去整合素对血小板聚集的抑制作用可归功于其对αⅡbβ3整合素的抑制，其含有的RGD序列可与αⅡbβ3整合素相结合，阻断纤维蛋白原和其的相互作用，抑制多种诱导剂诱导的血小板聚集反应。整合素RGD序列也可以结合玻连蛋白受体αⅤβ3，通过阻断其与内皮基质细胞的黏附作用来诱导内皮细胞的凋亡，诱发出血现象。从B.insularis蛇毒中得到的一种RGD去整合素Insularin，就能够抑制ADP诱导的血小板聚集以及内皮细胞和固定化纤维蛋白原的黏附作用[21]。

2.5L-氨基酸氧化酶L-氨基酸氧化酶(LAAO)广泛存在于真菌、细菌、动物等各类有机体内，其中蛇毒LAAO研究最为广泛[22]。蛇毒L-氨基酸氧化酶(SV-LAAOs)是一类典型的核黄素酶，能催化L-氨基酸的氧化脱氨基作用，生成α-酮酸和氨和过氧化氢(H2O2)。SV-LAAOs结构上属于连接有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅基的同源二聚体糖蛋白，相对分子质量为100～150 kDa。由于含有辅基FAD的原因，SV-LAAOs在465 和380 nm处有典型的特殊吸收峰。

蛇毒L-氨基酸氧化酶SV-LAAOs具有多种药理作用，包括诱导细胞凋亡、水肿、溶血、出血以及杀菌、抗寄生虫、抗肿瘤和影响血小板等功能，其中多数功能活性都与 LAAOs催化反应的产物H2O2有关。SV-LAAOs既能促进血小板的聚集，也能抑制血小板的聚集，作用机制尚未完全明确，但可以确定和H2O2的生成有关。从B.pauloensis和C.cerastes毒素中分离到Bp-LAAO[23]和CC-LAAO[24]，这些SV-LAAOs组分可以诱导血小板的聚集功能，可能的机制是酶催化产生的H2O2可以促进TXA2的合成，进而诱导血小板的聚集反应。 从A.blomhoffiiussurensis和B.leucurus毒素中分离到的ABU-LAO[25]和Bl-LAAO[26]，这些SV-LAAOs组分可以抑制血小板的聚集功能，可能的机制是酶催化产生的H2O2干扰了GPⅡbⅢa和纤维蛋白原的相互作用。

2.6C型凝集素 C型凝集素是一类被广泛研究的蛇毒蛋白家族，主要包括2个因素，一是钙离子依赖(C-型)，二是糖识别(凝集素)结构域(carbohydrate-recognition domain，CRD)[27]。蛇毒中还有很多与上述结构类似的蛋白，不同之处在于C型凝集素样结构域(C-type lectin-like domain，CTLD)，即含有不完整或缺失CRD域，且一般情况下不具有钙离子结合特性。为避免这类蛋白名字(C-type lectin-like或-related protein)与C-type lectins发生混淆，将其命名为Snaclecs(Snake venom C-type lectins)，包括2个同源的亚基：α亚基(14～15 kDa)和β亚基(13～14 kDa)。蛇毒毒素中Snaclecs要远远多于C-type lectins。Snaclecs具有多种生物活性，包括抗凝活性以及影响血小板功能活性。一部分Snaclecs表现抑制血小板聚集的活性，另一部分则表现为激活血小板聚集的活性。Snaclecs可作用于血小板表面众多的受体蛋白，包括GPⅠb和GPⅥ受体、α2β1整合素以及CLEC-2(C-type lectin-like receptor 2)。一种从Calloselasmarhodostoma毒素中分离的蛋白rhodocytin(aggretin)，可作用于CLEC-2受体，表现出强烈的血小板激活作用[28-30]。分别从Echismultisquamatus毒素和E.carinatus毒素中分离的蛋白EMS16 Snaclecs，Echicetin能够通过作用于α2β1和GPⅠb受体来抑制血小板的聚集[31]。从E.sochureki毒素中分离的Sochicetin-A比较特殊，属于三聚体结构-(αβ)3，能够和α2β1整合素相互作用，从而抑制胶原诱导的血小板聚集[32]。其他Snaclecs，从A.bilineatus毒素中分离到的bilinexin、从Bitisarientans毒素中分离的bitiscetin、从B.jararaca毒素中分离的botrocetin、从T.mucrosquamatus毒素中分离的mucetin、从C.durissusterrificus毒素中分离的convulxin都能够诱导血小板的聚集[31,33-37]。从T.jerdonii毒素中分离的Jerdonuxin，则是四聚体结构-(αβ)4，通过和GPⅠb相互作用，便显出诱导血小板的功能[38]。

2.75′-核苷酸酶 5′-核苷酸酶能够催化核苷酸水解生成核苷和磷酸，能够降解由不同诱导剂诱导致密颗粒释放的ADP，所产生的腺苷也能发挥抑制血小板聚集的活性，可能的机制在于增加了血小板内cAMP的含量。cAMP能够通过减少细胞内Ca2+的含量来抑制血小板的激活，同时也会抑制细胞颗粒内含物的释放，从而激活血小板发生聚集反应[39]。

5′-核苷酸酶广泛存在于毒蛇类群中，从V.lebetina毒素中分离的VL5′NT属于同源二聚体5′-核苷酸酶，由相对分子质量为60 kDa的单体构成，能够抑制胶原和ADP诱导的血小板的聚集[40]。另一种5′-核苷酸酶是从T.gramineus毒素中分离的，是相对分子质量为74 kDa的糖蛋白，能够抑制ADP、胶原、花生四烯酸和离子载体A-23187诱导的血小板聚集反应[41]。

3 小结

机体的止血过程是一个复杂精密的反应过程，需要血小板、血浆蛋白、内皮细胞和皮下组织等多种组织细胞的协调作用。其中血小板的功能紊乱已成为机体血栓形成、炎症反应以及动脉粥样硬化等疾病的关键因素。抗血小板药物研发是血栓性疾病治疗中的一大关键[42]。目前，临床上最常用的抗血小板药物主要是环氧化酶抑制剂阿司匹林、磷酸二酯酶(ADP)抑制剂氯吡格雷等[43]。但已上市的抗血小板药物都有出血风险高[44]和一些其他不良反应，如氯吡格雷抵抗现象[45]。因此，开发新的低风险的抗血小板药物具有重要的意义。蛇毒中含有相当丰富的活性成分物质，能够作用于血小板发挥功能的各个环节，直接或间接地影响止血反应。本文调研了已知的能够影响血小板聚集功能的蛇毒成分，对其作用机制进行系统介绍。今后，会有越来越多蛇毒活性成分被深入研究，并运用到临床的血栓疾病诊断与治疗当中。