Toll 样受体4 与心肌缺血再灌注损伤研究的进展

高雅芬 马 骏

近来有研究发现，Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)在心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion，I/R)中起到有害作用。其一旦被激活，配体信号可以通过分别导致NF-κB和IRF-3/7活化的MyD88依赖和MyD88非依赖途径发生转导，并且随后刺激前炎症和免疫调节细胞因子基因表达。细胞因子释放有助于中性粒细胞激活、募集、粘附和渗透到心脏损伤部位，进一步延续炎症过程和细胞凋亡。本文针对TLR4的信号转导机制及其在心肌缺血再灌注损伤及心肌保护中的作用研究进展综述如下。

1.TLR4的基本结构与配体

(1)TLR4的基本结构 1985年TLRs(Toll-like receptors，TLRs)因其在果蝇胚胎发育作用的研究首次被发现，后来被证实其在固有免疫中发挥着重要作用。目前已知，在人类细胞中存在10种TLRs，其中6种位于细胞表面并可被多种外源、内源性配体激活(TLR1，TLR2，TLR4，TLR5，TLR6和TLR10)，4种在细胞内表达(TLR3，TLR7，TLR8和TLR9)，通常被核酸结构识别[1]。TLR在各种类型的细胞中表达，包括心肌细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞。人类TLR4是第一个被表征的哺乳动物Toll蛋白，人类心脏中TLR信使RNA的相对表达水平从TLR4、TLR2、TLR3、TLR5、TLR1、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10依次递减。TLRs是I型跨膜蛋白，由胞膜外区、胞浆区和跨膜区三部分组成，包括作为配体识别结构域的胞外C末端、中心跨膜结构域和类似于IL-1受体的胞质结构域。TLRs的胞外域由20-30个氨基酸组成，富含亮氨酸(L)，包括共有序列LxxLxLxxN。TLR4通常形成同二聚体来识别配体，随后通过促进其下游衔接子的募集来启动信号传导。

(2)TLR4配体 TLR4识别的配体分为外源性配体和内源性配体两大类。外源性配体主要为病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，如脂多糖，磷壁酸，肽聚糖，甘露糖和葡聚糖等，较常发生在机体对外界感染因素所产生的固有免疫过程中。在心肌I/R中，坏死心肌细胞产生的“危险信号”也可以激活免疫应答。因此，称为损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，作为内源性配体被TLR识别。近年来研究已证实，心肌I/R过程中可产生多种DAMPs激活TLR4，例如坏死心肌产生的热休克蛋白(heat shock protein，HSP)和高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)，I/R导致的细胞外基质成分发生改变，如纤维蛋白原、硫酸乙酰肝素、S100蛋白等[2]。此外，也有研究认为I/R中产生的活性氧及受体-质膜的物理改变同样能产生内源性DMAPs激活TLR4[3]。

TLR4识别配体的机制之一依赖于不同TLRs不同的胞外域残基。位于TLR胞外区氨基酸序列变异导致结构构象的变化，以识别不同的配体。此外，辅因子还可以反映TLR配体组成的多样性。TLR4形成同源二聚体结合辅因子，例如CD14，髓样分化蛋白2和脂多糖结合蛋白，进一步递送特定的分子，同时避免其他配体，确保DAMPs的正确检测。TLR4在内质网进行加工折叠时，辅因子也产生了重要的作用，确保TLR4可以到达指定的亚细胞区室，与配体结合并启动信号转导。

2.TLR4信号传导通路

(1)MyD88依赖通路 MyD88依赖通路是在TLR4激活后通过髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)启动的。MyD88是含Toll /IL-1受体(Toll/interleukin-1 receptor，TIR)结构域的接头蛋白，其羧基端连接活化后TLR4的胞内TIR样区，氨基端结合IL-1受体相关激酶4(IL-1 receptor associated kinase 4，IRAK4)，并激活其他IRAK家庭成员之一，IRAK1或IRAK2[4]。通过与磷酸化的IRAK1缔合募集TNF受体相关因子-6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)并将其磷酸化。此后，磷酸化的TRAF6从受体解离并与转化生长因子β激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)，TAK1结合蛋白-1(TAK1-binding protein 1，TAB1)和TAB2形成复合物。该复合物结合泛素连接酶从而激活IKKα/IKKβ/IKKγ，并诱导IκB磷酸化。磷酸化IκB从复合物解离，并直接泛素化和蛋白酶体降解，转录因子NF-κB被激活释放。除了激活IKK复合物，TAK1还可以激活促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路，如ERK通路，JNK通路和p38通路。MAPK信号通路可以激活转录因子激活蛋白-1(AP-1)。NF-κB和AP-1的活化有助于促炎细胞因子如IL-6，IL-1和TNF-α的表达。

(2)MyD88非依赖途径 TLR4还可以通过MyD88非依赖途径进行信号传导，亦称TRIF依赖途径。由含TIR样结构的接头蛋白TRIF(TIR domain-containing adapter-inducing interferon，TRIF)和TRIF相关适配子(TRIF-related adapter molecule，TRAM)启动，可以导致干扰素调节因子(interferon regulatory，IRF)和NF-κB两者的激活和随后的干扰素(interferon，IFN)和促炎细胞因子表达。

TRAM和TRIF启动后，可与TRAF相关NF-κB激酶1(TBK1)和IKK-ε相互作用，使IRF3磷酸化。TRIF还可以与IRAK1和IKK-ε相互作用，用于激活IRF7。活化的IRF3/7转移到细胞核中，与DNA结合，并产生如IFN-β的抗病毒分子。在MyD88非依赖途径中，TRIF也能激活NF-κB。类似于MyD88依赖途径，TRIF可募集TRAF6和TAK1，通过泛素依赖机制激活NF-κB和MAPK。此外，TRIF也能直接通过募集受体相关作用蛋白1(receptor interacting protein 1，RIP1)激活NF-κB。因此，TRIF既能通过与TBK1和IRAK1相互作用激活IRF，也能通过招募TRAF和与RIP1相互作用激活NF-κB，RIP1能与fas相关死亡蛋白相互作用，触发caspase级联反应诱导细胞凋亡。

3.TLR4与心肌缺血再灌注损伤

近来有研究发现，TLR除了在防御病原体入侵的宿主免疫中发挥着重要作用，其固有免疫的激活也参与I/R的急性炎症反应。当从受损心肌细胞释放的“危险”信号(DAMPs)与模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)相互作用时，启动免疫应答。Frantz等首次在梗死心肌的重构组织中发现了TLR4表达的增强[5]。Vilahur G等在猪的闭合性冠状动脉闭塞模型实验中发现了与TLR4-MyD88-NF-κB通路和TRIF依赖通路相关的促炎症因子和抗病毒分子水平均升高[6]。

(1)TLR4信号通路与心肌再灌注损伤中的有害作用 Oyama 等首次报告了TLR4在小鼠心肌I / R损伤中的有害作用。与野生型小鼠相比，TLR4缺陷型小鼠可减少心脏炎症反应和缩小心肌梗死面积[7]。近年来，Louwe等发现内源性TLR4抑制剂RP105的缺乏可导致炎性状态增强，并且在诱导心肌梗死后心脏扩张更显著，强调了TLR4信号途径在心肌梗死后对心肌重构的作用[8]。而RP105的过度表达可导致TLR4，P38-MAPK和AP-1信号传导途径的失活，抑制随后产生的凋亡级联反应，从而减轻心肌I/R[9]。也有研究表明，心肌缺血损伤后，硫酸乙酰肝素可以通过TLR4/NF-κB，PI3K / AKT途径增加细胞间粘附分子1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子(VCAM-1)的表达，这有利于脾脏单核细胞和骨髓粒细胞与心脏成纤维细胞粘附，触发心肌成纤维细胞分化为心肌纤维细胞形成瘢痕[10]。然而，对于I/R后心脏功能的恢复，研究结果不一致，Kim等表明TLR4缺陷小鼠在I/R后，其血清细胞因子水平降低和心肌梗死面积减小，但是心脏功能并未恢复[11]，Fallach等的实验结果则相反[12]。

心肌I/R引起强烈的炎症反应，涉及多形核嗜中性粒细胞的渗透、活性氧的生成以及活化补体的形成[13]。有研究发现，小鼠心脏I/R模型中，在再灌注过程中输注中性粒细胞，心肌细胞TLR4缺陷的心脏中性粒细胞浸润更少，然而，输注TLR4缺陷型中性粒细胞，不影响心脏中性粒细胞的浸润[14]，提示心肌细胞TLR4是中性粒细胞浸润所需要的。另外一项研究发现，白细胞TLR4也参与心肌细胞损伤，丹参多酚酸盐可能通过抑制单核细胞Toll受体4的环节来降低单核细胞黏附分子的表达和黏附能力，进而减轻心肌损伤[15]。Hally KE等人还发现，急性心肌梗塞的患者中血小板TLR4数量显着上调[16]。不同细胞TLR4的分布和激活在I/R中心肌损伤的作用尚需进一步探讨。ROS生成除了由中性粒细胞激活释放外，还可能通过激活TLR4上调诱导型一氧化氮合酶(NOS2)和环氧化酶的表达，增加ROS的产生。缺血再灌注后期TLRs水平及炎症因子表达水平再次升高，可能损伤心肌结构和功能，其分子机制可能与凋亡(Bcl2、Bax、p53、活性caspase-3)， TLR4-MyD88依赖途径、TRIF途径，Akt-mTOR-P70S6K轴激活和纤维化(TGF-β，胶原蛋白A1 / A3)相关。此外，有研究表明巨噬细胞清道夫受体A类(SR-A)是TLR4的辅助受体，以促进炎症反应，抑制细胞存活和促进细胞凋亡[17]。

另有研究发现，与心肌I / R损伤后的野生型小鼠相比，TLR4缺陷小鼠的心肌中活化Akt的水平显著增加，表明TLR4-MyD88-NF-κB通路和PI3K-Akt信号通路之间存在相互调节[18]。推测PI3K-Akt信号通路的激活可能是TLR4缺陷小鼠心肌保护机制的反应，PI3K-Akt信号通路可最终作用于线粒体和K+通道，减少mPTP开放和增加K+通道开放来实现心肌保护作用。

(2)TLR4信号通路与心肌再灌注损伤中的心肌保护 许多研究已经提出，抑制TLR4信号通路可以减弱炎症反应和心肌I/R导致的细胞凋亡[19-22]。另一种新型TLR4拮抗剂异丁司特(Ibudilast)被发现可以抑制促炎细胞因子，如TNF和IL-6的产生，并诱导中枢神经系统中抗炎细胞因子IL-10的产生[23]。但也有研究表明，I/R后应用祖细胞治疗时，其迁移可能依赖于TLR信号传导，TLR4信号传导的治疗性阻断可能会干扰心肌细胞的再生[24]。TLR4或其下游基因的一些配体如脂多糖(LPS)、磷酸葡聚糖(GP)、HMGB1等可以用作预处理诱导剂，增强对心肌I / R损伤的心肌保护。LPS预处理的心肌保护作用在TLR4(-/-)或MyD88(-/-)心肌细胞中并不能体现。此外，使用NOS2抑制剂后消除了LPS处理增强心肌细胞存活和功能恢复的作用。说明MyD88，TLR4，NOS2参与了LPS配体介导的心肌保护[25]。在大鼠I/R模型中，发现用GP预处理可减少大鼠心肌再灌注后的梗死面积，其机制涉及减少TLR4与MyD88的结合，抑制I / R诱导的IRAK和IKKβ活性以及降低NF-κB活性。此外，GP增加TLR4酪氨酸磷酸化，导致心肌中PI3K-Akt活性增加，这与I/R后心肌细胞凋亡减少相关。同样，亚剂量的HMGB1可以诱导心肌I/R保护，而当PI3K-Akt药物拮抗剂LY294002与HMGB1联合给药时，预处理效果被废除[26]。这些数据强烈表明在心肌I/ R损伤期间TLR4-MyD88-NF-κB通路和PI3K-Akt信号通路之间存在相互调节。值得注意的是，LPS预处理诱导心肌保护时，至少需要在心肌缺血前8h接受预处理，而GP预处理在心肌缺血前1h和缺血发生后5分钟内就可以通过相关机制产生心肌保护。这表明GP的心肌保护机制与LPS不同。这些实验也表明TLR4及其下游基因可能是潜在的治疗靶点，用这些分子预处理可以降低与心肌I/R相关的发病率和病死率。

HSP60作为TLR4内源性DAMPs的一种，激活TLR时与LPS、GP预处理产生心肌保护的作用却恰恰相反。在小鼠心肌I/R模型中，内源性产生的HSP60通过TLR4-MyD88-p38/NF-κB通路诱导细胞因子产生，并通过TLR4-MyD88-JNK/NF-κB通路上调TLR4的表达，最终引起心肌炎症[27]。同样，外源性的重组HSP60通过心肌细胞中的TLR4诱导凋亡。TLR4信号由LPS或易位HSP60激活导致细胞分别存活和凋亡的机制尚不清楚，可能与TLR4识别配体时参与的特异辅因子的不同有关。由此可见，TLR4在应答非感染性损伤时，在介导组织炎症和细胞存活中发挥着广泛的作用。

4.总结 大量证据表明，TLR4通过MyD88依赖途径增强许多促炎基因表达，从而加重心肌损伤。抑制TLR4信号通路是心肌炎症的缓解方法，然而对心脏功能恢复的保护作用仍然有质疑。直接抑制TLR4可能导致其固有的免疫机制功能丧失，TLR4在心肌内同时参与宿主免疫和组织修复过程， TLR4可以激活MyD88非依赖途径，并进一步促进IFN-β表达，对心肌炎症产生有益作用。

此外，靶向TLR4信号通路的预处理可以有效地减轻心肌I/R。一些其他信号传导途径可以与TLR4信号传导途径相互调节，并对心肌炎症发挥调节作用。例如PI3K-Akt信号通路参与心肌I/R过程中的心肌保护，并且减少TLR4缺陷小鼠不良的心肌重塑。在调节TLR4信号传导期间是否可减少心肌炎症的同时保证免疫的优势是需要进一步研究的重要问题。