T细胞负性共刺激分子与肿瘤的研究

王若峥， 马苗苗

(1新疆医科大学附属肿瘤医院放疗中心， 乌鲁木齐 830011； 2中国医学科学院肿瘤免疫与放疗研究重点实验室， 乌鲁木齐 830011)

耗竭性T细胞是指在病毒及肿瘤抗原长期的刺激下T细胞发生的一种功能障碍状态，主要特征为T细胞表面负性共刺激分子表达水平升高，相关细胞因子分泌减少和效应T细胞杀伤能力下降[1]。这一概念最初在小鼠中慢性脉络丛脑膜炎病毒感染淋巴细胞中首次被提出，随后在病毒介导的肿瘤免疫微环境中发现T细胞耗竭[2]。T细胞耗竭伴随细胞功能下降，首先细胞毒性杀伤功能下降，其次是细胞因子产生能力下降，这包括白细胞介素 2(interleukin 2，IL-2)、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(tumor ecrosis factor-α，TNF-α)。除部分功能下降，耗竭性T细胞负性共刺激分子表达水平升高，效应T细胞相关分子表达降低。在肿瘤免疫微环境中，经过上述过程，致抗肿瘤免疫应答能力弱，进一步促进肿瘤的发生和发展[1]。

近年来关于肿瘤微环境的研究越来越多，已经成为研究的热点及焦点。微环境中肿瘤免疫抑制最为重要的原因是T细胞功能的耗竭，而阻断这些负性共刺激分子通路可以促进T细胞抗肿瘤的作用。研究表明，细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4)、程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(T cell immuneglobulin-andmucin domain containing molecule-3，Tim-3)和B和T淋巴细胞弱化子(B and T lymphocyteattenuator，BTLA)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)、TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain protein，TIGIT)等负性共刺激分子高表达是肿瘤T细胞耗竭的重要功能性标志，且多表达于活化的CD4+和CD8+T细胞[3]，参与T细胞免疫反应的负调节。阻断这些负性共刺激分子的信号通路后，耗竭T细胞的功能能够得到较好的恢复。

1 CTLA-4分子

CTLA-4又称CD152,是T细胞表面重要的共刺激分子之一。CTLA-4基因位于2号染色体长臂33带(2q33)上，与CD28分子属于同一家族，均可与抗原呈递细胞(antigen-presenting cells，APC)表面的B7受体分子相结合[4]。但CTLA-4与B7 分子结合力较强，能够与 CD28 分子竞争性结合 B7分子，阻断 CD28 与 B7 分子产生的信号通路，起到负性调节T细胞的增殖、分化的作用。同时CTLA-4与B7分子结合抑制了细胞因子的分泌和细胞周期的进程[5]。

目前国内外学者针对CTLA-4基因多个位点多态性与肿瘤基因易感性做了大量研究工作[6]，从中筛选出CTLA-4-318、CT60、+49 AA基因多态性与宫颈癌发生、发展有关，同时影响T细胞的分化功能。在与肺癌的研究易感性的研究主要集中在49 A>G(rs231775)，60 G/A(rs3087243)、1661 A/G(rs4553808)和1661 A/G(rs4553808)[7]。另一项研究表明，Treg/CD4+比值和 Treg细胞表面CTLA-4表达率在晚期非小细胞肺癌患者的表达率明显高于癌旁组织[8]。针对上述研究，为了有效地帮助患者抗肿瘤的免疫治疗，一些学者将T细胞抗原CTLA-4与HPV16 E7和E6融合为一种融合治疗DNA疫苗(pctla4-e7e6)，进一步在小鼠体内验证，具有较高的抗肿瘤特异性和相对较强的特异性CTL反应，该疫苗的研发可能为宫颈癌患者提供一个新思路[9]。最近一项临床试验报道了抗CTLA-4单克隆抗体Ipilimumab，治疗复发性宫颈癌中的安全性和抗肿瘤活性研究，结果显示Ipilimumab在人群中可以耐受，并能介导抗CTLA-4特异性的免疫应答，但这一药物的推广还需大量和长期的临床观察[10]。

2 PD-1分子

PD-1又称CD279 ，是在发生程序性死亡的细胞株中发现，故被命名为程序性死亡受体。PD-1基因位于2号染色体2q37.35位置，该蛋白属于免疫球蛋白超家族[11]。PD-1表达于人多种类型细胞中，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、活化的单核细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)。它的配体称程序性死亡配体-1(programmed deathligand-1，PD-L1)，又称B7-H1或CD274，通常表达于肿瘤细胞表面。肿瘤细胞的PD-L1的胞外区与活化T细胞表面高表达的PD-1结合，通过PD-L1/PD-1通路抑制T细胞增殖和分泌细胞因子，进一步抑制细胞抗肿瘤免疫反应[12]。

PD-1在肿瘤浸润性T细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)表达明显增高，PD-L1+肿瘤细胞的持续存在抑制TIL中PD-1的活化介导肿瘤细胞逃避免疫监视，参与肿瘤的发生和发展。近来文献报道多种肿瘤异常表达PD-L1，其表达水平与患者临床病理特征如肿瘤大小、分期、淋巴结浸润、患者预后等相关[13]。在肿瘤微环境中，PD-L1的表达通常伴随着组织浸润的T淋巴细胞数量减少，与肿瘤的分期和不良预后相关[13]。PD-L1与PD-1的结合还能抑制CD4+T细胞向Th1和Th17细胞分化和炎性细胞因子的释放[14]。PD-L1与PD-1阻断剂已在部分肿瘤的临床治疗中应用，当与手术或放疗联合使用时，明显改善部分患者生存期。目前FDA批准的癌种覆盖黑色素瘤、肺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞癌、尿路上皮癌，在其他癌种已开展临床试验，也取得了一定疗效[15]。

3 Tim-3分子

Tim基因家族于2001年被Mcintire等发现，因其包含免疫球蛋白IgV样和黏蛋白结构域而被命名为Tim[16]。人类Tim基因定位于5号染色体5q33.2上，目前发现的Tim基因包括3种：Tim-1、Tim-3和Tim-4。Tim-3配体包括半乳糖凝集素(galectin，Gal-9)、磷酯酰丝氨酸、癌胚抗原相关细胞黏附分子1和高迁移率族 B1蛋白等。其中，Gal-9是 Tim-3天然配体，表达于各种类型的免疫细胞表面，二者结合后，形成 Tim-3-Gal-9信号通路，引发广泛的免疫调节效应[17]。Tim-3主要表达于分化成熟的Th1表面，其与相应配体结合后，作为负性调节因子，负性调节免疫应答。Tim-3与这些共表达细胞可影响细胞周期的维持、细胞增殖，以及细胞因子，如IL2、TNF-α与IFN-γ等的分泌，诱导CD8+T 细胞的无能或者耗竭[18]。

在肝癌免疫微环境中研究发现Tim-3上调，并进一步促进肝癌细胞增殖[19]。在宫颈癌患者体内，Tim-3处于高表达状态，其表达程度与癌症进展和转移有关，多因素分析显示Tim-3表达是预测宫颈癌预后的独立因素，与宫颈癌的转移密切相关[20]。相关研究发现[19]，肿瘤患者体内阻断Tim-3/PD-1信号通路后，CD8+T细胞Tim-3可恢复分泌细胞因子功能，并可有效地控制肿瘤的生长。在肿瘤浸润的DC细胞表面也高表达Tim-3，Tim-3可通过与B1蛋白相互作用减少肿瘤死亡细胞的核酸进入DC中，进而抑制核酸引起的抗肿瘤免疫反应[21]。另外，肿瘤进展过程中促进调节性T细胞(regulatory cells，另称Treg)的产生，进一步影响肿瘤患者预后，这一过程与Tim-3介导NK细胞的下调相关[22]。基于上述的机制研究，近些年开展Tim-3阻断剂Ipilimumab在肿瘤患者中的研究，结果表明部分患者从中获益。

4 BTLA 分子

BTLA是分布于细胞膜表面的跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞质区这3个部分构成。人BTLA基因定位于3号染色体 3q13.2。BTLA及其配体等在进行基因筛选实验时发现Th1细胞表达一种特异性序列。BTLA不仅在T细胞中表达，在NK细胞、B细胞、DC细胞及巨噬细胞中也有不同程度的表达。BTLA与(herpes virus enter medium，HVEM)配体结合，能抑制T细胞的活化与增殖，也能抑制IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子的分泌和下调机体的体液免疫反应[23]。

在肺癌、卵巢癌肿瘤组织TIL上检测到CD4+T、CD8+T细胞BTLA的表达明显增高，从而推测BTLA可能与癌症发生、 发展存在关联[24]。还有研究表明BTLA基因多态性与乳腺癌肿瘤的异质性和不良病理特征相关[23]。近期有研究者采用流式细胞技术检测恶性卵巢癌患者腹水中T细胞上BTLA表达情况，结果发现CD4+T细胞BTLA阳性率为37.6%，CD4+T细胞BTLA阳性率为15.7%，进一步发现腹水中TNF-α和IL-6水平较低与CD8+T细胞免疫抑制明显相关[25]。在宫颈癌的小鼠模型中，构建了BTLA胞外结构域的真核表达质粒，该质粒可以与BTEM的配体HVEM结合，阻断BTLA-HVEM相互作用，提高抗肿瘤免疫力，并通过增加Th1细胞因子、IL-2、IFN-γ和降低肿瘤微环境中IL-10，转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)和叉头翼状螺旋转录因子(factor forkhead box protein 3，Foxp3)的转录水平。另一项研究表明，阻断BTLA-HVEM与HSP70疫苗组合时在体内与现有的肿瘤细胞产生协同效应[26]。目前有关BTLA的研究多处于基础实验阶段。

5 LAG-3分子

LAG-3也称CD223，是免疫球蛋白超家族成员中的跨膜蛋白。LAG-3 基因位于12号染色体12p13.3位置，该蛋白是由470个氨基酸组成，其配体为MHC-II分子[27]。LAG-3分子主要表达于活化的T细胞及NK细胞表面，与配体MHC-II有高度亲和力，结合后可抑制Th1 细胞增殖分化及减低IFN-γ、TNF-α和IL-2等细胞因子的分泌。LAG-3也可抑制CD8+T细胞活性，它也是Treg发挥作用所需重要分子。通过使用抗LAG-3阻滞剂可以增强CD8+T细胞的增殖能力，恢复Th1细胞的分泌细胞因子功能，促进IFN-γ的增多和细胞毒性作用，能明显的抑制Treg的功能[28]。

研究发现，在小鼠的黑色素瘤和结肠癌的模型中，CD4+T细胞上共表达PD-1和LAG-3分子[29]。另一项研究发现，在结肠癌CT26细胞系中，检测到CD8+T细胞表面同样共表达PD-1和LAG-3分子，进一步分析LAG-3可控制T细胞增殖和影响细胞周期进展，进而导致T细胞功能障碍[30]。在头颈部鳞状细胞癌以及非小细胞肺癌患者中检测到LAG-3优先表达在具有肿瘤侵袭性Treg上，在血液恶性肿瘤中，LAG-3 mRNA已被证实是慢性淋巴细胞白血病患者的预后标志物[31]。目前有4种靶向LAG-3单克隆抗体和新型试剂已作为抗肿瘤治疗剂进入研究，研究提示LAG-3可能是靶向单一抗肿瘤疗法的候选，在部分肿瘤中与抗PD-1组合可大大提高抗肿瘤效果。

6 TIGIT分子

TIGIT又称Vsig9和Vstm3，也是一种跨膜蛋白分子，基因位于16号染色体上，其蛋白结构包括一个免疫球蛋白可变区、一个型跨膜蛋白，外区带有一个免疫球蛋白结构域，胞内含有ITIM结构域，部分结构域是T细胞、NK细胞共同拥有的抑制性受体[32]。它的配体包括CD155和CD122，与CD155结合的亲和力最高。TIGIT与CD155结合后，抑制T细胞、NK细胞的活化，增强DC细胞和APC分泌IL10细胞因子能力，间接抑制T细胞的活化，进一步抑制细胞免疫应答[33]。

研究表明，TIGIT分子在T细胞亚群中有不同程度的表达，在Treg上高表达，在记忆性T细胞上低表达，而在 CD4+CD25-T细胞上仅在活化后表达。Marmarelis等[34]研究检测了来自肺癌细胞系中T细胞亚群的TIGIT表达，肺癌细胞系的CD8+T细胞中TIGIT与对照组表达的任何差异，但肺癌细胞系CD4+TIGIT成高表达状态，并且病期越晚CD4+T细胞TIGIT明显升高。另一项研究，通过流式细胞技术检测浸润性膀胱癌患者外周血T细胞负性共刺激分子TIGIT的表达，与健康患者相比表达显着增高[35]。也有研究在黑素瘤模型中报道了CD8+T细胞和Treg表示TIGIT[32]。 目前，TIGIT对T细胞和NK细胞功能的影响逐渐受到越来越多的重视。

T细胞表面免疫抑制点，不仅仅是上述4种，还有糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factorreceptor，GITR)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(leukocyte-associated Ig-like receptor 1，LAIR-1)、诱导共刺激分子(inducible costimulate molecule，ICOS)等，针对上述免疫抑制点在肿瘤中的研究正逐步开展。目前有关抗T细胞负性共刺激分子药物已有上市，如CTLA-4抗体、PD-1/PD-L1通路阻滞剂等，且在临床治疗中效果较好，有些药物取得了15%～40%的有效率，但多数处于早期临床试验阶段。

目前美国FDA批准的负性分子抗体药物主要是单抗体药物，在临床中主要与手术、放化疗结合使用。已知在肿瘤恶变过程中，肿瘤微环境中T细胞表达多种负性共刺激分子，多重阻滞可能会给患者带来更多获益。虽然近些年T细胞免疫抑制的相关研究进展较快，但其中的机制有待阐明。其次，在临床中药物毒性评估仍然需要确定，何种组合策略最有效，还需要进一步探索。