复合微生物制剂对小鼠生长性能及免疫功能的影响

张 伟

（安庆医药高等专科学校临床医学系，安徽安庆246052）

复合微生物制剂是指由两种或两种以上互不拮抗的微生物菌种经科学配方合成的制剂，具有配伍合理、优良性强等优点。目前，关于复合微生物制剂功能的研究大多集中于改善土壤环境、提升水产动物生长性能，改善水体环境等方面［1-3］。刘军辉研究表明，施用复合微生物制剂后，盐碱地土壤PH、EC值显著下降，土壤微生物数量及肥力逐年提升，土壤改良效果明显［4］。杨桂芳等研究表明，利用复合微生物制剂处理制药厂废水效果显著优于单一微生物处理，净化制药废水效果显著［5］。吕远蓉等研究表明，饲喂复合微生态制剂可显著提升肉鸡生长性能，同时肠道微生物菌群显著改善，屠宰性能提高［6］。符冬岩等研究表明，在基础饲料中添加复合微生物制剂可显著提升鲤鱼生产性能，同时浮游动植物数量明显下降，水质显著改善［7］。王雄等研究表明，在基础饲料中添加复合微生物制剂可显著提升银鲫的血清溶菌酶活性［8］。而关于复合微生物制剂对动物机体免疫功能的影响方面的研究报道尚不多见。因此，本文研究了自行研制的复合微生物制剂对小鼠生长性能及免疫功能的影响，以期为将来开发利用提供理论依据。

1 实验材料及方法

1.1 实验材料及仪器

1.1.1 实验材料

实验用小鼠为6周龄昆明种雄性SPF级小鼠及基础日粮购自北京维通利华实验动物技术有限公司。复合微生物制剂主要由光合细菌、乳酸菌、酵母菌及芽孢杆菌组成，自行研制。刀豆蛋白（ConA）、四甲基偶氮唑蓝（NTT）购自美国sigma公司，新生牛血清购自美国gibco公司，绵羊红细胞（SRBC）、淋巴细胞裂解液购自上海生工生物工程有限公司，二甲基亚砜（DMSO）购自天津瑞金特化学品公司。

1.1.2 实验仪器

BS224S型电子天平，Thermo 3032型CO2培养箱，200XUSB型电子显微镜，D-35720型离心机，DG5033型酶标仪，镀铬游标卡尺，L5型紫外可见分光光度计，DK-S22恒温水浴锅，SW-CJ-2G超净工作台等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验设计与饲养

选取200只6周龄的昆明种SPF级雄性小鼠，适应性饲养1周后，按体重随机分为4组，每组50只，称量其体重并记作为初始体重。分组饲养阶段，将复合微生物制剂分别按照日粮的3%（低剂量组）、6%（中剂量组）和9%（高剂量组）加入到饲料中，搅拌均匀，直接饲喂。实验组小鼠采取同室分笼饲养，保持室内清洁卫生，控制昼夜交替12 h，温度23℃，湿度50-60%，采食饮水自由，饲养6周后，饥饿过夜12 h，称重、解剖采样，进行相关指标测定。

1.2.2 小鼠免疫器官指数测定

饲喂实验结束后，每组取10只小鼠的脾脏和胸腺进行称重，并按照如下公式计算免疫器官指数：胸腺指数=胸腺质量（mg）/小鼠体重（g）；脾脏指数=脾脏质量（mg）/小鼠体重（g）。

1.2.3 小鼠血清半数溶血值HC50测定

饲喂实验结束后，每组取10只小鼠，分别注射0.2 mL的2%绵羊红细胞悬浮液进行免疫，4 d后摘除眼球并分离血清，采用曹发昊的方法［9］进行血清半数溶血值HC50测定。

1.2.4 小鼠溶血空斑数测定

饲喂实验结束后，每组取10只小鼠，分别注射0.2 mL的2%绵羊红细胞悬浮液进行免疫，4d后摘除脾脏并制备脾细胞悬浮液，按照改良玻片法［10］测定溶血空斑数。

1.2.5 小鼠淋巴细胞增值能力测定

饲喂实验结束后，每组取10只小鼠无菌取脾脏，制备细胞悬浮液，用刀豆蛋白（ConA）对脾淋巴细胞进行刺激，采用MTT比色法［11］测定小鼠脾淋巴细胞的增值能力。

1.2.6 小鼠足跖厚度测定

饲喂实验结束后，每组取10只小鼠分别于腹腔注射0.2 mL 5%的绵羊红细胞，经4 d致敏反应，测量各小鼠左后足跖厚度。在测量部位二次注射20 μL 20%的绵羊红细胞，进行二次致敏，于24 h后测定其厚度，并计算2次测量的厚度差值。

1.2.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数测定

饲喂实验结束后，每组取10只小鼠，分别于腹腔注射1 ml20%的鸡红细胞悬浮液，采用颈椎脱臼法处死，采用柳璐的方法［12］计算巨噬细胞数、吞噬鸡红细胞巨噬细胞数和被吞噬鸡红细胞数，并采用如下公式计算吞噬率和吞噬指数：吞噬百分率＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数／计数的巨噬细胞数×100%；吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数总数／计数的巨噬细胞数。

1.2.8 小鼠碳粒廓清指数测定

末次饲喂1 h后，每组选取10只小鼠分别从鼠尾静脉处注射0.05 mL·1og-1g的稀释印度墨汁，并按如下公示计算碳粒廓清指数：K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1），其中，OD1为t1时（2 min）血标本光密度值，OD2为t2时（10 min）血标本光密度值。

1.2.9 小鼠NK细胞活性测定

饲喂实验结束后，每组取10只小鼠无菌取脾，并制备成单细胞悬浮液，采用乳酸脱氢酶法［13］分别测定反应孔OD值、自然释放孔OD值和最大释放孔OD值，并按照如下公式计算NK细胞活性：NK细胞活性（%）=（反应孔OD值-自然释放孔OD值）/（最大释放孔OD值-自然释放孔OD值）×100%。

2 实验结果及分析

2.1 复合微生物制剂处理对小鼠生长性能的影响

不同剂量的复合微生物制剂处理对小鼠生长性能的影响如表1所示，对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的初始体重统计学差异不显著，但是经饲养5周后，4组小鼠的平均体重分别增长 10.95 g、12.86 g、14.43 g 和 14.69 g。与对照组相比，低剂量组复合微生物制剂处理显著增加小鼠的体重，中剂量组和高剂量组处理极显著增加小鼠体重。这表明，复合微生物制剂处理会显著增加的小鼠的生长性能。

表1 复合微生物制剂处理对小鼠生长性能的影响（n=10）

2.2 复合微生物制剂处理对小鼠免疫器官指数的影响

脾脏和胸腺是小鼠重要的免疫器官，对免疫功能具有显著影响。复合微生物制剂处理对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响如表2所示，与对照组相比，复合微生物制剂处理显著增加了小鼠脾脏指数，其中，中剂量组增加幅度最大，达到1.47 mg·g-1；与对照组相比，低剂量组复合微生物制剂处理显著增加小鼠胸腺指数，而中、高剂量组处理则极显著增加小鼠胸腺指数，其中，高剂量组增加幅度最大，达到0.7 mg·g-1。这表明，复合微生物制剂处理可显著增加小鼠的免疫器官指数。

表2 复合微生物制剂处理对小鼠免疫器官指数的影响（n=10）

2.3 复合微生物制剂处理对小鼠体液免疫功能的影响

血清半数溶血值HC50和溶血空斑数是衡量动物体液免疫功能强弱的重要指标。复合微生物制剂处理对小鼠血清半数溶血值HC50和溶血空斑数的影响如表3所示，与对照组相比，低剂量组复合微生物制剂处理可显著增加小鼠血清半数溶血值和溶血空斑数，中、高剂量组复合微生物制剂处理可极显著增加小鼠血清半数溶血值和溶血空斑数，其中高剂量组处理增加幅度最大，分别达到18.05，24.5。这表明，低剂量复合微生物制剂处理可显著增加小鼠体液免疫功能，中、高剂量组处理可极显著增加小鼠体液免疫功能。

表3 复合微生物制剂处理对小鼠体液免疫功能的影响（n=10）

2.4 复合微生物制剂处理对小鼠细胞免疫功能的影响

淋巴细胞增值能力和足跖厚度与小鼠细胞免疫功能强弱息息相关。复合微生物制剂处理对小鼠细胞免疫功能的影响如表4所示，与对照组相比，低、中剂量组复合微生物制剂处理显著增强小鼠的淋巴细胞增长能力，高剂量组处理极显著增强小鼠淋巴细胞增长能力，最大增幅达到0.075；与对照组相比，低、中剂量组复合微生物制剂处理显著增加了足跖厚度，高剂量组处理极显著增强小鼠足跖厚度，最大增幅达到0.15 mm。这表明，低、中剂量的复合微生物制剂处理可显著增加小鼠的细胞免疫功能，而高剂量组的复合微生物制剂可极显著增加小鼠的细胞免疫功能。

表4 复合微生物制剂处理对小鼠细胞免疫功能的影响（n=10）

2.5 复合微生物制剂处理对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

巨噬细胞是动物免疫细胞的重要类型，通过吞噬病原体来实现机体的免疫功能。复合微生物制剂处理对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响如表5所示，与对照组相比，低剂量的复合微生物制剂处理可显著提升小鼠巨噬细胞的吞噬率、吞噬指数及碳粒廓清指数；与对照组相比，中、高剂量组复合微生物制剂处理可极显著提高小鼠巨噬细胞的吞噬率、吞噬指数及碳粒廓清指数，增幅分别达到12.8%、0.11及1.95。这表明，低剂量的复合微生物制剂处理可显著提升小鼠巨噬细胞吞噬功能，中、高剂量复合微生物制剂处理可极显著提升小鼠巨噬细胞的细胞吞噬功能。

表5 复合微生物制剂处理对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响（n=10）

2.6 复合微生物制剂处理对小鼠NK细胞活性的影响

自然杀伤细胞（natural kill cell，NK）是动物体内一类与B、T淋巴细胞并列的非常重要的免疫细胞，具有杀伤介质、识别靶细胞等重要功能，不仅与自身免疫调节、抗病毒感染等息息相关，而且与时常参与超敏反应等的发生。复合微生物制剂处理对小鼠NK细胞活性的影响如图1所示，与对照组相比，低、中、高剂量组复合微生物制剂处理均可显著提升NK细胞的活性，其中，高剂量组复合微生物制剂处理提升幅度最大，达到79.58%。这表明，复合微生物制剂处理可显著提升自然杀伤细胞的活性，提升免疫功能。

3 结论

动物的免疫系统由免疫器官、细胞、分子等组成，是机体发生免疫反应的物质基础。免疫器官指数是初步衡量机体免疫功能的指标，而以B、T细胞为主的体液免疫和细胞免疫则是反应机体免疫调节功能的重要参数，巨噬细胞的吞噬能力是衡量动物机体非特异性免疫功能强弱的重要指标，NK细胞是与B、T细胞并列的第三类群淋巴细胞，其活性高低与机体免疫功能强弱显著相关。因此，本研究从免疫器官指数、体液免疫、细胞免疫、巨噬细胞吞噬及NK细胞活性等方面研究了复合微生物制剂处理对小鼠免疫功能的影响，结果表明，复合微生物制剂不仅提升了小鼠的生长性能而且显著提高了小鼠的机体免疫功能，其中尤以中、高剂量处理效果最佳。

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