法氏囊活性肽BP-I对禽流感H9N2灭活疫苗的免疫佐剂特性

（河南科技大学 动物科技学院，河南洛阳 471023）

1 前言

法氏囊（bursa of Fabricus，BF）是禽类B 细胞生长的最初发生位置，B 细胞生长成熟后由此转移至周边淋巴器官定居与增殖，实现免疫功能。法氏囊微环境里具备多种促使B 淋巴细胞生长的生物活性物质，近年来，法氏囊组织里陆续分离鉴定出多条活性肽，其中BP-I是从法氏囊组织中新分离的生物活性肽，其免疫学作用尚不清晰，本研究拟通过人工合成法氏囊生物活性肽BP-I和禽流感H9N2灭活疫苗配合运用接种小鼠，通过测定小鼠体内免疫指标水平变化评价BP-I对禽流感H9N2灭活疫苗免疫佐剂特性，开拓了佐剂的研发领域。

2 试验材料与方法

2.1 主要材料

28日龄BALB/c普通级老鼠80只购自河南郑州大学实验动物中心，公母对半；禽流感疫苗（H9N2 亚型，SDS696株）购自乾元浩生物股份公司；禽流感病毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）和pET32a-HA（H9N2）质粒，由本实验室保存。BP-I标准品由上海科肽生物科技有限公司合成，纯度＞95%。HRP标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体、TMB 底物、显色液均购自郑州鼎国生物技术有限责任公司；小鼠细胞因子含量测定 ELISA 试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。

2.2 试验方法

2.2.1 动物分组及免疫

将80只28日龄BALB/c小鼠随机分为4组，每组20只，分别是PBS组，单独疫苗组、单独疫苗+BP-I组和空白组，采取肌肉注射（i.m.）方式分别对各组小鼠（空白组除外）进行两次免疫，每次免疫间隔2周，即所有组分别于0、14d进行首免和二免。

2.2.2 血清IgG抗体的测定

首免后7、21d分离小鼠血清，并采用ELISA方法检测小鼠血清 H9N2 HA 抗体。

2.2.3 血清中IL-4和IFN-γ的测定

首免后7、21d对小鼠进行采血，如图2-2-d所示，并分离小鼠血清，采用小鼠细胞因子含量测定 ELISA 试剂盒检测血清中IL-4和IFN-γ的含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。每次分析时，使用对照的细胞因子标准品绘制标准曲线，通过标准曲线来计算血清中细胞因子的含量。

2.2.4 动物免疫保护试验

二免2周后（即首免后28d），经口服途径对各实验组小鼠（20只/组）攻击H9N2型禽流感病毒毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）100 μL（2.5×106TCID50/0.1 mL），设空白对照组，攻毒后各组小鼠隔离饲养。于攻毒后第7d分别从各组随机抽取5只小鼠分离其肺脏，制作肺脏的HE切片来分析病变情况。HE染色及切片的制备委托武汉谷歌生物有限公司完成。

2.2.5 统计学处理

3 结果

3.1 免疫小鼠血清中IgG抗体水平

于首免后7、21d分离小鼠血清进行IgG 抗体检测，结果如图1所示，首免后7d和21d时，疫苗+BP-I组和疫苗组小鼠血清中IgG抗体分泌水平均显著高于PBS组（P＜0.01），疫苗+BP-I组小鼠血清IgG抗体分泌水平显著高于疫苗组（P＜0.01），且首免后21d时较首免后7d时各组IgG抗体水平均进一步提高。表明法氏囊活性肽BP-I 能显著提高免疫H9N2型AIV疫苗后小鼠IgG抗体分泌水平。

图1 免疫 小鼠血清IgG抗体平均水平

3.2 小鼠血清细胞因子水平

首免后7、21d分离小鼠血清，采用小鼠细胞因子含量测定ELISA 试剂盒检测血清中IL-4和IFN-γ的含量，以分析BP-I对H9N2型AIV疫苗免疫后小鼠的细胞免疫水平的影响。IL-4的分泌水平如图2所示，7d与21d时均是：疫苗+BP-I组和疫苗组的细胞因子IL-4的分泌水平差异不显著（P＞0.05），疫苗组与PBS组的IL-4的分泌水平差异极显著（P＜0.01），疫苗+ BP-I组与PBS组的IL-4的分泌水平差异极显著（P＜0.01），表明法氏囊活性肽 BP-I对于提高免疫后小鼠体内细胞因子IL-4分泌水平作用不显著。IFN-γ的水平变化如图2所示，7d与21d时均是：疫苗+BP-I组和疫苗组小鼠血清中IFN-γ的分泌水平均显著高于PBS组（P＜0.01），疫苗+BP-I组小鼠血清中IFN-γ的分泌水平显著高于疫苗组（P＜0.01），且首免后21d时较首免后7d时各组IFN-γ的分泌水平均进一步提高，表明法氏囊活性肽BP-I能够提高免疫后小鼠体内细胞因子IFN-γ的分泌水平。

图2 免疫后各组小鼠细胞因子IFN-γ和IL-4水平变化

图3 小鼠免疫后各组肝脾指数变化

3.3 小鼠肝脏和脾脏指数变化分析

小鼠的肝脏和脾脏指数的变化如图3所示，首免后7d和21d时均是：疫苗+BP-I组与疫苗组的肝指数差异不显著（P＞0.05）；疫苗+BP-I组和疫苗组的脾指数差异不显著（P＞0.05）。说明法氏囊活性肽BP-I对免疫后小鼠的肝指数和脾指数变化的作用不显著。

3.4 免疫小鼠的免疫保护试验

由于H9N2型禽流感病毒毒株A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）不能使小鼠出现明显的临床症状和导致死亡，为有效评价各实验组小鼠免疫保护力的差异，于二免2周后，对小鼠攻击A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）100 μL（2.5×106TCID50/0.1 mL），同时设空白对照组，在攻毒后7d从各组随机抽取5只小鼠采集其肺脏，制作肺脏的HE切片，和正常肺脏相比，PBS组肺泡壁出血严重，肺泡腔内出现大量浆液和中性粒细胞；疫苗组与PBS组相比，肺泡壁出血减少、中性粒细胞减少；疫苗+BP-I组与疫苗组相比，肺泡壁出血明显减少、中性粒细胞明显减少。表明法氏囊活性肽BP-I配合疫苗能够有效促进小鼠肺脏中病毒的清除，从而对小鼠起到免疫保护的效果。

4 讨论

血清IgG抗体水平能够反映被免疫动物的体液免疫应答能力，其检测结果准确性较高，并且检测操作步骤比较简便。本试验结果显示，法氏囊活性肽BP-I配合禽流感H9N2灭活疫苗，在两次免疫后可以显著增强小鼠血清中IgG抗体水平，提高机体的体液免疫水平，对特异性免疫应答调节有着重大意义。细胞因子是一组在体内免疫细胞或非免疫细胞中产生的异质性肽类调节因子。细胞因子具有广泛的生物活性，对免疫应答的产生和调节具有重要作用，是评价机体细胞免疫状况的一个重要的免疫指标。细胞因子在体内能激活和调节免疫活性细胞，IL-4和IFN-γ分别为Th2和Th1类免疫反应的代表性细胞因子。试验结果显示法氏囊活性肽BP-I配合禽流感H9N2灭活疫苗免疫小鼠能够显著提高IFN-γ的分泌水平，对IL-4的分泌水平影响不显著，能够提高机体细胞免疫水平。小鼠脾脏的变化情况能够表现总体的免疫变化，肝脏也是重要的脏器，而且取材较方便。肝脾指数可以较好地反映出小鼠机体的免疫情况。本实验在首免后7d和21d时随机取小鼠的肝、脾并称重，并计算肝脾指数。结果表明：疫苗+ BP-I组的肝指数和疫苗组差异不显著；疫苗+ BP-I组的脾指数和疫苗组差异不显著。说明法氏囊活性肽BP-I与疫苗配合使用对小鼠肝脏和脾脏指数变化影响不大。本试验在二免2周后对小鼠进行动物免疫保护试验。由于选用的 H9N2亚型禽流感病毒毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）不能使小鼠出现明显的流感临床症状和导致死亡，而且以2.5×106TCID50的剂量感染小鼠后该病毒主要分布在其肝脏、脾脏和肺脏，其中肺脏中的带毒量最多。因此，为有效评价BP-I的佐剂特性，我们只做了HE切片，结果显示，攻毒后7d时疫苗+BP-I 组几乎观察不到小鼠肺脏的病变。表明BP-I 配合疫苗使用能够抑制AIV 在小鼠肺脏中的复制。

法氏囊活性肽BP-I配合疫苗使用能显著提高小鼠血清中IgG抗体的分泌水平。能显著提高小鼠血清内细胞因子IFN-γ的分泌水平，对IL-4的分泌水平影响不大。对小鼠的肝脏和脾脏指数变化的作用不显著。法氏囊活性肽BP-I配合疫苗使用会增强对小鼠肺脏的免疫保护作用。

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