小鼠心脏缝隙连接蛋白节律性表达与生物钟系统相关性

柴莹，周影，陈晓敏，童茂清

（宁波市第一医院，浙江 宁波 315010，1.中西医结合科；2.分子医学实验室；3.心内科）

心律失常是心血管系统常见病、多发病，心肌细胞的异常兴奋（如离子通道功能异常等）和细胞间传导异常（如缝隙连接蛋白异常等）是心律失常发生的主要原因。鉴于心律失常发病的显著节律性，大量研究探索了生物钟与心律失常的可能联系。YAMASHITA等[1]的研究显示，几种心脏钾离子通道基因的表达有显著的节律性。本课题组前期研究提示，视上核可能通过自主神经系统调节着心脏离子通道的节律性表达[2]。然而，心脏缝隙连接蛋白基因的表达是否同样具有节律性，及其与生物钟系统的相关性尚未见报道。为此，本研究观察在小鼠心脏中缝隙连接蛋白基因的表达情况，以及生物钟系统对缝隙连接蛋白基因的调节作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 6周龄C57BL/6小鼠[购自南京大学模式动物研究所，生产许可证号为SCXK（苏）2010-0001]和Clock mutant小鼠（购自美国杰克逊实验室）各40只被单独饲养在12 h光照/12 h黑暗环境下2周（8：00开灯，20：00关灯），可自由进食饮水。本研究通过宁波大学医学院实验动物福利委员会批准。1.2 RNA回收及实时荧光定量PCR 在苯巴比妥钠麻醉下，每6 h处死10只小鼠，快速回收心房、心室组织，保存于RNA保存液中（RNAlater，美国赛默飞世尔公司）。采用RNeasy1 Fibrous Tissue Mini kit（德国Qiagen公司）回收总RNA，反转录之前检测RNA的浓度和纯度，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，以GAPDH作为内参，在StepOne-PlusTM（美国ABI公司）上检测各基因mRNA水平。反应条件为：94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。实验中使用的PCR引物见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 统计学处理方法 各基因的mRNA水平的24 h变化节律用least-squares cosine-curve fitting法分析。以下参数被用于分析昼夜节律的特点：①节律的显著性；②周期性变化数值的算术平均值；③振幅和时相。各参数用 ±s表示，2组参数的比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Clock变异小鼠的生物钟系统失去正常功能在野生型小鼠的心房和心室中，生物钟基因Per2

和钟控基因Dbp的mRNA水平显示出显著的昼夜节律性；在Clock变异小鼠中，两基因表达均失去节律性，且各基因表达的均值和振幅均显著低于野生型小鼠，表明该小鼠体内的生物钟系统失去正常功能。见图1。

2.2 小鼠心脏中缝隙连接蛋白基因的表达呈显著昼夜节律性 在野生型小鼠的心脏中，两种缝隙连接蛋白基因Cx40和Cx43的mRNA水平具有显著的昼夜节律性：在心房中，两基因的表达峰值均出现在光照阶段，而在心室中，仅Cx43的表达峰值出现在光照阶段（见图2）。在Clock变异小鼠中，心脏内的两种缝隙连接蛋白基因表达的节律性依然存在，但其节律的时相性发生显著变化：在心房中，Cx40和

图1 生物钟基因在心房（A）和心室（B）中的表达情况（n=10）

图2 缝隙连接蛋白基因在心房（A）和心室（B）中的表达情况（n=10）

Cx43的表达时相显著后移；而在心室中，两基因的表达时相显著前移。Clock变异小鼠心室中两基因表达的均值较野生型小鼠显著增加，而两基因表达的振幅及在心房内表达的均值差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2-3。

表2 各基因在野生型及Clock变异小鼠心房中的表达节律相关参数比较（n=10， ±s）

表3 各基因在野生型及Clock变异小鼠心室中的表达节律相关参数比较（n=10， ±s）

3 讨论

心律失常的发生与异常心肌细胞电活动及（或）细胞间电传导异常相关，这涉及一系列的心脏离子通道和缝隙连接蛋白基因。在过去40多年里，大量证据提示了缝隙连接和缝隙连接蛋白对正常心脏功能的重要性[3-4]。缝隙连接蛋白是构成缝隙连接的基本单位，现在已知的缝隙连接蛋白有20多种，其中有4种在心脏中表达，包括Cx40、Cx43、Cx45和Cx30.2[5]。在心血管疾病中，其分布异常或表达下调，从而导致心律失常基质的产生。例如慢性压力超负荷/左室收缩功能不全大鼠模型中，心肌细胞Cx43阳性缝隙连接的减少和（或）分布异常与房颤的高发密切相关[6]，心肌细胞缝隙连接重塑也与高甘油三酯血症大鼠增加的室颤发生率相关[7]

心律失常的发病有显著的昼夜节律性，研究表明这与离子通道基因表达及功能的节律性、心脏生理功能对自主神经系统的反应有关[8]。哺乳动物的生物钟中枢位于下丘脑的视上核，此外在包括心脏的几乎所有的外周脏器中均存在外周生物钟系统。视上核通过自主神经/神经体液途径发出的信号驱动并同步化各种行为和生理过程的节律。当视上核被破坏后，这种节律性被打乱并引起一系列的下游效应[9]。

本研究利用Clock变异小鼠观察了Cx40和Cx43基因在心脏中的表达节律，Per2和Dbp基因被用作正常生物钟系统功能的标志，结果显示在野生型小鼠中，Cx40和Cx43的表达呈显著节律性，而在Clock变异小鼠中，这种节律性虽然保持，但其时相发生显著变化，这意味着在正常的生物钟功能缺失的情况下，缝隙连接蛋白基因的表达与外界环境失去同步性。

许多心血管参数如血压、心率等均表现出明显昼夜变化，这一现象之前主要被归因于外界环境刺激的昼夜变化。随着对生物钟系统研究的不断深入，生物钟在心血管系统中的作用日益受到重视。生物钟可能给心脏提供了一种手段，使得心血管系统可以“预测”外界环境的变化，从而可以提前做好准备并做出最适当的反应，而生物钟系统功能的异常可能会损害这一机制进而导致心血管疾病的发生[10-11]。HAVAKUK等[12]的研究发现，夜班轮班工人的心血管疾病发病率高于白班轮班工人，提示反复变化的作息时间可能导致生物钟系统功能受损，进而导致心血管疾病的发生。反之，心血管疾病也可能导致其本身的外周生物钟系统的异常，进而加重原有疾病。YOUNG等[13]报道，在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中，心脏的生物钟系统功能受损。本研究显示在机体生物钟系统丧失正常功能时，Cx40和Cx43基因表达节律紊乱，这可能导致心脏电生理功能无法与机体的需求同步。

本研究结果提示了生物钟系统可能参与了缝隙连接蛋白基因的节律性表达，而生物钟功能异常会引起这一节律的紊乱，在未来研究中深入观察在各种心血管疾病患者及动物模型中生物钟与缝隙连接蛋白基因的相关性将有可能进一步阐明这一调节的分子机制，并有可能发现新的心律失常的治疗靶点，而对每个患者个体生物节律的评估则有可能为疾病的个体化治疗提供更多依据。