四氢嘧啶对凝乳酶热稳定性的影响

武彬+石天虹+刘雪兰+阎佩佩+井庆川

摘要：为研究四氢嘧啶对凝乳酶热稳定性的影响，向凝乳酶溶液中加入0.175～5.600 mmol/L的四氢嘧啶，测定不同浓度四氢嘧啶对凝乳酶活力的影响；之后测定了含0.50～2.00 mmol/L四氢嘧啶的凝乳酶溶液在69℃保温不同时间后的凝乳酶活力，将热保温后的酶溶液在4℃复性36 h，并再次测定酶活力的变化。结果显示，不同浓度四氢嘧啶对凝乳酶活力影响不大，各组酶活力均降低8.2%左右；加入四氢嘧啶会显著降低凝乳酶的热稳定性，但会发生明显的复性作用，提示四氢嘧啶可能具有维持部分失活态凝乳酶稳定性的作用。

关键词：四氢嘧啶；凝乳酶；热稳定性；复性作用

中图分类号：S879.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）01-0131-04

Abstract To study the effect of ectoine on the thermostability of rennin， 0.175～5.600 mmol/L ectoine were added into rennin solution to determine the effects of ectoine concentration on rennin activity， and then the rennin solutions added 0.50～2.00 mmol/L ectoine were heated in water bath at 69℃ for different time， and renaturated at 4℃ for 36 hours. The changes of rennin activities after water-bath and renaturation were both determined. The results showed that different concentrations of ectoine had little effects on rennin activity， and the rennin activity decreased by about 8.2%.When ectoine was added into rennin solution， the thermostability of rennin decreased and renaturation would significantly happened， which indicated that ectoine might be essential for keeping the stability of partial inactivated rennin.

Keywords Ectoine； Rennin； Thermostability； Renaturation

凝乳酶是制作乳酪和干酪素必需的酶制劑，能水解牛奶中κ-酪蛋白的Phe105-Met106肽键，使牛奶凝结，经过一系列加工过程后制成乳酪[1]。医学研究结果表明，凝乳酶还具有治疗儿童消化不良的临床作用[2]。凝乳酶与其他酶制剂一样，在生产和应用中，高热、冻融、辐射、有机溶剂等都可能使酶变性失活，导致酶活力损失。乳酪加工对凝乳酶的添加量有严格的要求[3]，而作为药品制剂也要求凝乳酶能够保持较高的稳定性。固定化、化学修饰和蛋白质工程等方法都能够提高酶制剂的热稳定性，而添加糖类、多元醇、聚合物等稳定剂的方法适用范围广，作用效果较好，得到了广泛应用。

Ectoine（1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，简称四氢嘧啶）是Galinski等[4]发现的在耐盐微生物中所广泛含有的一种渗透压补偿性溶质，具有稳定天然蛋白质水化层，保护酶和DNA等生物大分子和细胞膜结构，提高其稳定性等作用。四氢嘧啶能够提高中性蛋白酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶、糖化酶、植酸酶等酶制剂的热稳定性，其最佳使用浓度相差很大。魏胜华等发现提高中性蛋白酶热稳定性的四氢嘧啶最佳添加浓度为5.0 mmol/L，可使该酶残余活力提高51.8%[5]；王越等研究表明，四氢嘧啶提高脂肪酶热稳定性的最佳浓度为1.5 mmol/L[6]。李强等报道对于超氧化物歧化酶，四氢嘧啶浓度在0.1～0.7 mmol/L对其热稳定性的作用效果最佳[7]。酶的热失活是温度和时间复合作用的结果，但大部分研究在测定酶的热稳定性时，多选取固定保温时间，没有跟踪酶活力随保温时间变化的情况。

目前，关于稳定剂对酶的保护机理多是在海藻糖的研究结果上提出的玻璃态假说、水替代假说和优先排阻假说[8]，关于四氢嘧啶对酶的保护机理研究不多。本试验主要研究了四氢嘧啶对凝乳酶热稳定性的影响，研究结果有助于增强四氢嘧啶提高酶制剂稳定性作用机理的理解。

1 材料与方法

1.1 试验材料

四氢嘧啶购自Sigma公司，纯度>98%；凝乳酶购自Sigma公司；脱脂奶粉购自伊利实业有限公司；其他试剂均为分析纯；水为二次去离子水。

1.2 试验方法

1.2.1 凝乳酶活力测定与相对酶活力计算 凝乳酶活力测定采用Arima法[9]：凝乳酶以0.02 mol/L pH 6.0的磷酸缓冲液稀释800倍，以此为原液，取0.5 mL，在35℃预热5 min，加入到5 mL 35℃预热的pH 6.0、含1% CaCl2的10%脱脂牛乳中，计时至管壁出现颗粒，记录凝乳时间（T）。以35℃ 40 min凝乳1 mL牛乳的酶量为一个酶活力单位（U）。凝乳酶活力及相对活力的计算公式如下：

凝乳酶活力A=5×24000.5×T×n ； （1）

凝乳酶相对活力Ar=ApA0×100% 。 （2）

式中，T为凝乳时间，s；n为稀释倍数，本试验为1；Ap为经过各种处理后凝乳酶的残余活力，U；A0为未经任何处理的凝乳酶活力，U。endprint

1.2.2 四氢嘧啶对凝乳酶活力影响的测定 取凝乳酶原液与分别含有0.175、0.350、0.525、0.700、1.050、1.400、2.800、4.200和5.600 mmol/L四氢嘧啶的混合酶液，测定其酶活力，并计算凝乳酶相对活力。

1.2.3 热失活处理 1.5 mL离心管中加入1.2 mL含有0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和2.00 mmol/L四氢嘧啶的凝乳酶溶液，放入69℃水浴并立即开始计时，每分钟取样一次，样品取出后立即转入冰水中快速降温，然后取0.5 mL酶液测定残余凝乳酶活力。

1.2.4 复性处理 将1.2.3中经过热失活处理并降温的不含四氢嘧啶与含有0.75 mmol/L四氢嘧啶的凝乳酶液转入冰箱4℃静置36 h后取出，取0.5 mL测定凝乳酶活力，计算相对酶活力，并与1.2.3中结果进行比对。

2 结果与分析

2.1 四氢嘧啶对凝乳酶活力的影响

凝乳酶通过水解κ-酪蛋白生成副κ-酪蛋白，继而发生蛋白质胶体聚集并形成化学键而使牛奶凝结。四氢嘧啶是一种渗透压补偿性溶质，能够与凝乳酶分子表面和内部的基团结合，引起凝乳酶分子氢键和其他分子间作用力的改变，这可能会影响凝乳酶催化活力的正常发挥。由图1看出，加入的四氢嘧啶浓度在0.175～5.600 mmol/L范围内，凝乳酶活力均降低8.2%左右。

2.2 四氢嘧啶对凝乳酶热稳定性的影响

在加入四氢嘧啶后，凝乳酶的热稳定性都有不同程度地降低，四氢嘧啶为0.75 mmol/L时，能测到酶活力的热处理时间最长，处理7 min相对活力仍保留9%且其相对酶活力也明显高于其他浓度组；其他浓度保温4～6 min后，即无法测到酶活力（凝乳时间>600 s，酶活力损失>93.3%）；当四氢嘧啶浓度大于2.00 mmol/L时，即使保温时间为1 min的样品也无法测到凝乳酶活力（图2）。

2.3 四氢嘧啶對凝乳酶复性的作用

试验结果表明，不含四氢嘧啶凝乳酶的对照组，在复性前后酶活力基本保持不变；而含有四氢嘧啶的凝乳酶复性作用十分显著。热处理时间3 min以上时，复性效果较为显著，复性导致的相对酶活力提升保持在10%～15%；热处理5 min以上，复性后的含四氢嘧啶的凝乳酶相对酶活力高于不含四氢嘧啶的对照组（图3）。

3 讨论与结论

魏胜华等认为四氢嘧啶能够改变酶分子的氢键缔合，增加β-折叠结构，维持酶分子构象从而提高酶制剂的热稳定性[5]。然而，四氢嘧啶添加量显著影响到其对酶的保护作用，过量的四氢嘧啶会抑制酶活力[6]。Meyer等发现四氢嘧啶增强了DNA分子从双螺旋结构向开环结构的变化[10]，其原因可能是由于大分子所带电荷对四氢嘧啶的影响。本研究结果表明，加入0.175～5.600 mmol/L四氢嘧啶后，凝乳酶活力均降低8.2%左右，该结果与王越报道的四氢嘧啶提高植酸酶热稳定性的结果截然不同[11]，这可能与凝乳酶和植酸酶分子结构的差别有关。

目前，二步串联失活动力学模型能够很好地分析和解释某些酶的失活过程[12]，模型如下：

ENKEDKiEi 。 （3）

式中，EN为活性态酶；ED为部分失活态酶；Ei为完全失活态酶；K为可逆失活步骤中的平衡常数；Ki为不可逆失活步骤的失活速率常数。酶的热失活过程的发生分为两步，首先活性态的酶EN先可逆失活为部分失活态酶ED，然后部分失活态酶ED不可逆失活为完全失活态酶Ei。

本研究结果显示，加入0.50～2.00 mmol/L的四氢嘧啶，都会使凝乳酶的热稳定性显著降低，其中，四氢嘧啶浓度为0.75 mmol/L时，酶活力降低的最慢。另外，处于部分失活状态的凝乳酶在经过36 h复性处理后，酶活力又有一定的回升，热处理3～7 min复性作用最为显著，相对酶活力提升了10%～15%。该结果可能提示四氢嘧啶具有诱导凝乳酶结构向部分失活态转变并维持该状态保持相对稳定的作用。

参 考 文 献：

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