乳酸菌和纳豆芽孢杆菌对黄曲霉毒素B1和伏马毒素B1的吸附作用研究

姜富贵+韩红+陈雪梅+李祥明+盛清凯

摘要：为了研究乳酸菌和纳豆芽孢杆菌对霉菌毒素的吸附作用，采用L9（34）正交试验设计，研究不同菌浓度、环境温度及吸附时间对吸附作用的影响。结果表明，乳酸菌和纳豆芽孢杆菌对黄曲霉毒素B1和伏马毒素B1的吸附作用主要受菌浓度的影响（P<0.05），温度和时间对吸附强度无显著影响。浓度为1×109 CFU/mL时，乳酸菌对黄曲霉毒素B1的吸附强度（18.02%）显著高于纳豆芽孢杆菌（13.88%）（P<0.05），对伏马毒素B1的吸附强度（13.45%）显著低于纳豆芽孢杆菌（17.62%）（P<0.05）。建议提高菌群数量及种类以去除饲料中霉菌毒素的危害。

关键词：乳酸菌；纳豆芽孢杆菌；黄曲霉毒素B1；伏马毒素B1；吸附作用

中图分类号：S182文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）01-0127-05

Abstract To investigate the adsorption of Lactobacillus and Bacillus natto on mycotoxin， the L9（34） orthogonal experimental design method was used to study the effects of different bacterial concentrations， environmental temperatures and times on adsorption in this experiment. The results showed that the adsorption of Lactobacillus and Bacillus natto on aflatoxin B1 and fumonision B1 were mainly affected by their concentrations （P<0.05）， but not significantly affected by adsorption time and environmental temperature. The adsorption intensity of Lactobacillus on aflatoxin B1 （18.02%） was higher than that of Bacillus natto （13.88%） at the concentration of 1×109 CFU/mL， whereas that of Lactobacillus on fumonision B1 （13.45%） was lower than that of Bacillus natto （17.62%） （P<0.05）. So increasing the amounts and species of microorganisms should be proposed to reduce the risk of mycotoxin in feed.

Keywords Lactobacillus； Bacillus natto； Aflatoxin B1； Fumonision B1； Adsorption

霉菌毒素是一类在霉菌生长过程中产生的有毒次级代谢产物[1]。动物饲喂霉菌毒素污染的饲料，会出现急性或慢性中毒症状，包括动物生长受到抑制，饲料利用率降低，动物产仔数、禽类产蛋率和孵化率下降等[2]。发酵脱毒法对饲料营养成分的损失小，是应用前景非常广阔的一种生物解毒方法，存在微生物吸附作用、酶降解作用以及有机酸抑制作用三种作用方式[3]，但发挥生物脱毒主效作用的方式到目前为止仍不清楚。虽然国家饲料添加剂品种目录（2013）规定饲料中可以允许添加的微生物有30多种，但具体哪种微生物的脱毒效果最好也难以判定。因此，本研究选取在饲料中常见且对动物和人影响较大的黄曲霉毒素B1和伏马毒素B1为研究对象，探索饲料中常用的乳酸菌和纳豆芽孢杆菌对两种霉菌毒素的吸附作用，以及环境温度和吸附时间对吸附作用的影响，旨在为去除饲料中的霉菌毒素提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

乳酸菌（植物乳杆菌）和纳豆芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌），由山东省农业科学院畜牧兽医研究所提供。黄曲霉毒素B1（AFB1）和伏马毒素B1（FB1），购自上海优甘生物科技有限公司。AFB1和FB1检测试剂盒，购自ROMER国际贸易北京有限公司。

1.2 试验设计与方法

试验采用L9（34）正交试验设计（详见表1）。分别取不同浓度菌溶液3 mL放入5 mL离心管中，然后于4℃冷冻离心机10 000×g离心10 min。弃去上清液，在沉淀的菌泥中加入3 mL灭菌生理盐水，然后轻轻吹打、混匀。向各离心管中分别加入50 μL霉菌毒素溶液（AFB1浓度为2 μg/mL，FB1浓度为50 μg/mL），混匀，在不同试验温度和160 r/min振荡条件下，培养相应时间。试验结束后，样品在4℃冷冻离心机10 000×g离心10 min，取出上清液，采用酶联免疫法测定霉菌毒素量，计算吸附强度。每试验重复3次，每次采样后平行3次测定。

吸附强度（%）=（1-上清液中霉菌毒素的量/试验前加入量）×100。

1.3 数据分析

采用SAS 9.1的PROC GLM过程分析各处理组的吸附强度，采用student-t检验进行比较，使用SAS程序的CORR过程对相关系数进行分析，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌浓度、温度及时间对AFB1吸附强度的影响

由表2可以看出，乳酸菌对AFB1的吸附强度在不同浓度间有显著差异（P<0.05），不同温度间和不同时间都没有显著差異（P﹥0.05）。乳酸菌浓度越高对AFB1的吸附强度越大。对AFB1吸附强度影响最强的因素是乳酸菌浓度，其次是时间，温度的影响最小。endprint

2.2 乳酸菌浓度、温度及时间对FB1吸附强度的影响

由表3可以看出，3种浓度乳酸菌对FB1的吸附有显著影响（P<0.05），乳酸菌浓度越高对FB1的吸附强度越大。对FB1吸附强度影响最强的因素是乳酸菌浓度，其次是温度和时间。

2.3 纳豆芽孢杆菌浓度、温度及时间对AFB1吸附强度的影响

由表4可以看出，3种浓度纳豆芽孢杆菌对AFB1的吸附有显著影响（P<0.05），纳豆芽孢杆菌浓度越高对AFB1的吸附强度越大。对AFB1吸附强度影响最强的因素是纳豆芽孢杆菌浓度，其次是时间和温度。

2.4 纳豆芽孢杆菌浓度、温度及时间对FB1吸附强度的影响

由表5可以看出，3种浓度纳豆芽孢杆菌对FB1的吸附有显著影响（P<0.05），纳豆芽孢杆菌浓度越高对FB1的吸附强度越大。对FB1吸附强度影响最强的因素是纳豆芽孢杆菌浓度，其次是时间和温度。

2.5 两种菌之间不同影响因素对不同毒素吸附影响的比较

由表6看出，菌种浓度为1×109 CFU/mL时，乳酸菌对AFB1的吸附强度显著高于纳豆芽孢杆菌（P<0.05），对FB1的吸附强度显著低于纳豆芽孢杆菌（P<0.05）；菌种浓度为1×108、1×107 CFU/mL时，乳酸菌对AFB1和FB1的吸附强度均显著高于纳豆芽孢杆菌（P<0.05），表明菌种的吸附与菌种种类和浓度相关。

由表7看出，乳酸菌和纳豆芽孢杆菌之间菌种浓度对于AFB1、FB1吸附强度k值的相关系数都大于0.9900，温度在0.8941～0.9684，而时间的相关系数最小，表明这两种菌在同等浓度、同样温度的条件下对同种毒素有相似的吸附，同样的吸附时间可能存在差异。

3 讨论与结论

吸附是指物质（主要是指固体物质）表面吸住周围介质（液体或气体）中分子或离子的现象。依据吸附剂与吸附质之间作用力的性质，吸附可分为物理吸附和化学吸附。物理吸附不具选择性，吸附作用力为范德华力，且不受温度影响；而化学吸附具选择性，吸附剂只对某些吸附质产生吸附作用[4]。本试验中乳酸菌和纳豆芽孢杆菌对AFB1、FB1的吸附受温度影响小，且对不同霉菌毒素吸附强度不同，推断乳酸菌和纳豆芽孢杆菌的吸附可能以物理吸附为主[5]。微生物细胞壁主要由甘露聚糖、葡聚糖和蛋白质等组成，含有-COOH、-NH2、-SH、-OH等官能团，这些物质中的氮、氧、硫等原子都可以提供孤對电子与霉菌毒素配位。目前未见纳豆芽孢杆菌对霉菌毒素的吸附报道。本试验中乳酸菌吸附AFB1的结果与Zeng等[6]、Khanafari等[7]和Huang等[8]一致，但与殷传振[9]结果不同，原因在于殷传振[9]是混合菌发酵处理，非单一菌的吸附试验。本试验乳酸菌吸附对FB1的吸附结果与Zhao等[10]和Zhang等[11]相同。乳酸菌、纳豆芽孢杆菌吸附霉菌毒素，这可能与微生物吸附重金属镉[12]、塑化剂[13]等相似，不同之处在于吸附强度存在差异。

本试验中对霉菌毒素吸附的主要影响因素为菌种浓度，其次为温度和时间，这与冯艳忠[14]结果相似。本试验结果显示乳酸菌和纳豆芽孢杆菌这两种微生物对AFB1和FB1这两种霉菌毒素的作用相似，不过本试验扩大了微生物种类和霉菌毒素种类。乳酸菌与纳豆芽孢杆菌对AFB1和FB1吸附强度的差异，可能源自乳酸菌与纳豆芽孢杆菌的细菌表层结构差异[15]以及AFB1、FB1的分子量、结构不同。菌种浓度为1×109 CFU/mL时乳酸菌对FB1的吸附强度低于纳豆芽孢杆菌，而1×108 CFU/mL时高于纳豆芽孢杆菌，其原因是否与两种菌的次级代谢物差异有关有待研究。

本试验中乳酸菌、纳豆芽孢杆菌吸附霉菌毒素，为霉菌毒素脱毒及降解创造了条件。尽管霉菌毒素被吸附后其危害仍然存在[16]，但乳酸菌、纳豆芽孢杆菌和蒙脱石等吸附剂[17]一样有助于霉菌毒素的体外排泄，减缓霉菌污染饲料的毒性。另外纳豆芽孢杆菌等的吸附还可能促进霉菌毒素与微生物分泌的酶制剂的接触，有利于霉菌毒素的酶解[18，19]。本试验中乳酸菌对AFB1的吸附强度为18.02%，低于发酵饲料的脱毒比例[3]，表明吸附作用在生物脱毒中处于次要、辅助作用，微生物分泌酶的酶解可能为主要作用。饲料发酵过程中乳酸菌、纳豆芽孢杆菌等扩繁，细菌数量不断增加，同时其分泌的霉菌毒素降解酶含量也同时增加，吸附和酶解二者之间的共同作用有待进一步研究。

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