平邑甜茶外源花粉授粉效果和生殖机能研究

高付凤+毛云飞+张佳腾+杨恒峰+王增辉+沈向

摘要：以平邑甜茶（Malus hupehensis）為母本，用“红丽”观赏海棠花粉进行人工授粉，设计不去雄不授粉不套袋、去雄授粉套袋、套袋花开后去雄授粉和去雄不授粉套袋四个处理，利用物理统计、显微观察、流式细胞仪等技术，研究不同授粉处理平邑甜茶坐果率、果实生理性状、后代实生苗杂种率和倍性的差异，进一步探索平邑甜茶的生殖机能，选择出平邑甜茶杂交率较高的时期以增加平邑甜茶的杂交率和杂交种子数，扩大选择范围，提高育种效率，为育种实践提供重要的理论依据。结果显示，经授粉处理后，平邑甜茶种子千粒重增加约8.7%；坐果率显著提高，10月时相比自然授粉状态下提高约10.1%。自然状态下平邑甜茶无融合生殖率约为43.70%，各处理杂交后代实生苗大部分为三倍体，少数为二倍体、四倍体、五倍体和非整倍体，且花开前去雄授粉套袋处理显著提高四倍体形成率。综上所述，人工授粉有助于提高坐果率，促进种子形成；平邑甜茶以无融合生殖为主，同时也进行有性杂交，且花开前授粉能显著提高四倍体形成率。但三倍体后代实生苗是经有性生殖还是无融合生殖产生，需进一步鉴定。

关键词：平邑甜茶；无融合生殖；倍性测定；荧光活性

中图分类号：S661.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）01-0023-06

Abstract Malus hupehensis was used as the female parent， and was artificially pollinated the pollen of Hongli ornamental crabapple. Four treatments including no emasculation and pollination with no bagging （T1）， emasculation and pollination with bagging （T2）， emasculation and pollination after flowering with bagging （T3）， emasculation and no pollination with bagging （T4） were conducted to research the differences in fruit setting rate， fruit physiological traits， offspring seedling hybrid rate and ploidy of Malus hupehensis by physical statistics， microscopic observation and flow cytometry. This study was aimed at further exploring the reproductive function of Malus hupehensis， selecting the period for high hybridization rate to increase the hybridization rate and the number of hybrid seeds， expanding the selection range， improving the breeding efficiency and providing important theoretical bases for breeding. The results showed that the seed weight increased by 8.7% after pollination； the fruit setting rate significantly increased by 10.1% compared with the natural pollination in October. The apomixes rate of Malus hupehensis was about 43.70%. Most of the hybrid offspring seedlings of the four treatments were triploid， and the diploid， tetraploid， pentaploid and aneuploidy were less.The tetraploid formation rate increased significantly under emasculation， pollination and bagging before flowering. In conclusion， artificial pollination was benefit for improving the fruit setting rate and promoting the seed formation. Malus hupehensis used apomixes as the main reproductive mode， and also had sexual hybridization.Pollination before flowering significantly increased the tetraploid formation rate. But it needed to be further identified that the reproductive mode of triploid offspring seedlings was sexual reproduction or apomixes.

Keywords Malus hupehensis； Apomixes； Ploidy determination； Fluorescence activityendprint

平邑甜茶（Malus hupehensis）是湖北海棠的一个变种，具有非常强的无融合生殖特性和嫁接亲和性[1]。平邑甜茶除具无融合生殖特性外，还可进行有性生殖[2]。植物无融合生殖具有复杂的发育过程，受多位点多基因控制，涉及多种基因之间不同时空表达的互作和协调抑制[3]，存在多种类型的发育机制，可认为是有性生殖发育“失调”或“短路”的结果[4]。按照胚体发生途径的不同可分为二倍体孢子、无配子和不定胚三种生殖类型。无融合生殖中存在兼性无融合生殖现象，且常伴随着多倍体现象，而其同种或相近物种有性繁殖的个体通常是二倍体[5]。杨峰等[6]用平邑甜茶与B9、M27、M9进行杂交，对后代杂种实生苗进行倍性测定，发现控制平邑甜茶无融合生殖性质的基因为显性，既有主效单基因质量遗传，也有多基因数量遗传。王颖等[7]用平邑甜茶与扎矮山定子杂交，获得6株皱叶矮生型株系，相比平邑甜茶其无融合生殖能力发生很大程度的退化，而有性生殖能力得到了恢复。大多数研究[3，6]是针对平邑甜茶的无融合生殖机理，对其有性生殖机理研究甚少，其有性生殖杂交率较高时期和后代倍性分离状况尚需探究。因此，筛选平邑甜茶杂交率较高的时期，扩大选择范围，增加平邑甜茶的杂交率和杂交种子数对育种工作具有重要意义。本研究利用“红丽”海棠（二倍体）对平邑甜茶（三倍体）进行授粉，分析不同授粉处理对平邑甜茶坐果率、果实生理性状、倍性、后代实生苗率和杂种率的影响，并进一步明确平邑甜茶有性生殖的机理与进程，选择出平邑甜茶杂交率较高的时期，以提高其杂交率，增加杂交种子数，扩大选择范围，提高育种效率，从而为育种实践提供重要的理论依据。

1 材料与方法

试验于2015—2016年在山东农业大学园艺科学与工程学院观赏果园资源圃、作物生物学国家重点实验室进行。

1.1 供试材料

母本和父本分别为山东农业大学南校区观赏果树资源圃的平邑甜茶（2005年种植）、“红丽”海棠（红叶，2007年种植），选择长势中庸、生长较为整齐一致的健康苗木，统一田间管理。

1.2 试验处理

试验共设4个处理，分别为不去雄不授粉不套袋（T1）、去雄授粉套袋（T2）、套袋花开后去雄授粉（T3）和去雄不授粉套袋（T4）。每个授粉组合选取3～5株长势相近、生长健康的植株，每株选取生长方位、粗度相似的枝干并随机选取状态基本一致的花序，每个花序保留1～2朵花，进行不同的授粉处理（见表1），其余均按常规管理方式统一管理，定期对各项指标进行测定。

1.3 试验方法

1.3.1 平邑甜茶授粉后坐果率 在“红丽”海棠花蕾期采集花粉，阴干备用。于2016年4月1日选择一定数目的铃铛期平邑甜茶花蕾，一部分进行去雄授粉套袋、去雄不授粉套袋处理，另一部分进行套袋，待其花开后（4月6日）去雄授粉。在授粉后4周（5月2日）、生理落果后（7月10日）和采果时（10月20日）统计各处理的坐果数，计算坐果率。

1.3.2 果实生理指标的测量 果实单果重、种子千粒重和果实纵横径分别用电子秤和游标卡尺进行测量。

1.3.3 幼苗叶片颜色、出苗率和杂交苗率 试验所得杂交种，经层积催芽处理（2016年1月10日—3月15日）后播种育苗并进行精细管理。幼苗生长约30天统计幼苗叶片颜色、出苗率和杂交苗率。

1.3.4 后代實生苗倍性测定 用已知倍性的父本“红丽”海棠（2x）和母本平邑甜茶（3x）为对照，参照文献[10]的方法取后代实生苗（经层积催芽播种后15天）的嫩尖叶片（约0.5 cm2），放入带盖的塑料培养皿中加入200 μL裂解液后用双面刀片（刀面垂直于叶片）快速剁碎，在室温条件下放置3 min，然后加入800 μL染色缓冲液，在4℃条件下避光染色5 min，然后用Partec公司的 20 μm Cell Trics TM 滤网过滤样品至样品管中，上样，利用流式细胞仪（德国）测定杂交实生苗的DNA含量，获取DNA含量柱形图，进而根据DNA含量确定其倍性。

1.3.5 柱头活性荧光检测 参照文献[11]和[12]的方法，人工授粉成功后，每隔12 h取一次柱头样品，72 h后停止取样，在荧光显微镜下观察拍照，并进行数据分析。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用 Microsoft Excel 2010和 DPS v7.05软件进行统计分析与做图。

2 结果与分析

2.1 不同授粉处理对坐果的影响

由图1可以看出，随着时间的推移，各处理平邑甜茶坐果率呈逐渐降低的趋势，5—7月的变化速率大于7—10月。不同处理的降速不同，T1处理降幅最显著，5—7月和7—10月的坐果率分别降低10.17和3.36个百分点，到10月果实采收时坐果率为82.44%，明显低于其他处理；T2、T3、T4 处理降幅较小，至10月时分别降低5.78、5.17和3.89个百分点，三者间差异不显著。

2.2 不同授粉处理对平邑甜茶果实性状的影响

由表2可以看出，平邑甜茶单果重和果实纵横径处理间存在显著差异，T2处理的单果重和果实纵横径显著高于其他处理，分别是T1处理的1.16、1.06、1.04倍；而T3、T4处理均显著或不显著低于T1，且两者间差异不显著。不同授粉处理的果形指数无显著差异，果实均为圆柱状。不同授粉处理对平邑甜茶种子形成影响不同，经过人工授粉处理的平邑甜茶单果种子数显著高于自然状态下，且以T2处理最高，为T1处理的1.68倍。种子千粒重T2、T3、T4处理间差异不显著，但均显著高于T1，相比T1分别增加了8.33%、9.52%和8.33%，表明经授粉处理的种子发育更为饱满。

2.3 不同授粉处理对后代实生苗出苗率和杂种苗率的影响

在后代实生苗中，T1处理杂种苗率最高，为7.99%，授粉处理杂种苗率均低于T1，且T4处理无杂种苗（表3）。从后代实生苗中筛选出了含有父本性状的实生苗，充分证明平邑甜茶是兼性无融合生殖。endprint

2.4 柱头荧光活性检测

由图2可见，在人工授粉12 h后，柱头上的花粉较多（图2-1），随着时间的推移，花粉逐渐减少（图2-2、图2-3），48 h后只有极少数花粉萌发（图2-4），60 h后只有极少数的花粉管长到花柱中间位置（图2-5），72 h后花粉管停止生长并出现萎蔫（图2-6）。在所观察的材料中没有发现花粉粒大量萌发的现象，只有极少量花粉管生长到了花柱下端（图2-7）。

2.5 平邑甜茶杂种后代实生苗倍性测定

经测定，二倍体“红丽”海棠和三倍体平邑甜茶的DNA相对含量分别为50和 84，理论推算二倍体DNA含量区间45～55，三倍体75～95，四倍体96～105（图3）。对T1、T2、T3和T4处理分别选取74、83、32和100株红叶杂交苗进行倍性测定（表4），除T4处理100棵幼苗全部为三倍体，T1、T2、T3处理都出现了倍性分离，其后代实生苗变异率分别为52.70%、38.55%、46.88%。其中，T1处理后代实生苗倍性分离最明显，出现了五倍体植株；T2处理四倍体出现概率最高，为19.28%，T3处理四倍体概率也较高，为15.63%，由此可见去雄授粉套袋处理有助于四倍体的出现。

表5为推断出的后代实生苗染色体倍性组成。由表4和表5可以看出，平邑甜茶后代的大部分三倍体实生苗是经无融合生殖产生的，少部分的三倍体和其余的整倍体、非整倍体需经过有性胚囊成功受精后才能得到。说明，平邑甜茶不仅有性生殖过程较为复杂，而且生成的有性杂种基因型也比较复杂。

3 讨论

薛志霞等[8]對红富士苹果进行异花授粉试验，发现“秦冠”花粉萌发量大，花粉管数量多且生长快，坐果率高，而且种子数量多且各心室都有分布，与红富士的亲和性较好。宁伟等[9]对丹东蒲公英的专性无融合生殖特性研究表明，进行去雄授粉套袋后其结籽率高达96%。本试验中人工授粉后平邑甜茶的种子千粒重显著优于自然授粉，这说明授粉处理有助于受精卵的形成和发育，使种子更为饱满。不同授粉处理中单果重以去雄授粉套袋处理最高，表明这一授粉处理有助于增产，这也解释了人工授粉是产量稳定的有效手段[10]。程光等[11]针对核桃落花落果严重，采取人工辅助授粉的方法，于4月下旬采集花粉选择合适时间授粉，可显著提高坐果率，而且在雌花开不整齐时二次授粉可比一次授粉提高7个百分点的坐果率。陈琳等[12]研究也表明不同授粉方式对黄连木果实形状和坐果率有显著差异，其中抖授方式平均坐果率最高，果实含油量和种子千粒重最高，种子空壳率最低。本研究结果也表明，人工授粉平邑甜茶坐果率显著高于自然授粉，高出8～9个百分点，特别是5—7月，人工授粉处理的坐果率下降速率明显低于自然状态。这可能由于柱头上存在黏性物质，人工授粉提高了附着柱头的花粉量和花粉粘性，从而提高花粉萌发量，进而促进受精卵的形成，提高种子的饱满程度和坐果率。李天忠[13]对自花和异花授粉“红星”苹果花粉管数进行显微镜观察，发现自花授粉处理的花粉管数显著少于异花授粉，异花授粉处理24 h后在花柱上部1/3处发现了细胞排列紧密、单层管壁且形状不规则的花粉管，48 h后可明显看到伸长的花粉管。本试验在对平邑甜茶人工授粉48 h后也明显看到萌发的花粉管，这与前人研究结果一致。此外，图像可见柱头上的花粉数目逐渐减少，一方面可能是由于花粉的自然脱落，另一方面可能是由于柱头上存在某种化学物质将花粉降解，最终观察到只有极少数花粉管长到花柱下端，这说明平邑甜茶可以进行有性生殖，但有性生殖率较低。

孟素琴等[14]发现平邑甜茶和二倍体苹果杂交后代实生苗中除三倍体外还含有少量四倍体和非整数倍体，且后代实生苗可以遗传母本平邑甜茶的无融合生殖能力。沙广利等[15]利用平邑甜茶与矮生有性砧木M9和B9等进行杂交，测得无融合生殖率在88.1%～92.1%之间，后代分离出分枝型、小叶的个体；杂交得到的有性杂种虽然具有较高的无融合生殖坐果能力，但是后代仍然有性状的分离。马荣群等[16]用流式细胞仪和SSR技术对苹果砧木青砧二号（三倍体）×宁8（二倍体）组合F1代杂种实生苗的22个单株进行倍性分析，后代出现了3株四倍体植株。本研究通过对平邑甜茶ד红丽”海棠杂交后代实生苗DNA含量的测定得到实生苗的倍性，发现去雄授粉套袋处理所测结果与前人一致，但自然状态下得到了4株五倍体，可能是由于平邑甜茶所处环境海棠种类众多，多种海棠对其授粉造成的。不同授粉处理中去雄授粉套袋处理后代出现4倍体杂种苗概率明显高于其他处理，表明可通过在花蕾期对平邑甜茶去雄授粉套袋获得四倍体。本研究通过倍性测定推断出平邑甜茶雌配子体的类型为1x、2x和3x，这与沙广利[15]的研究结果一致，但对于其三倍体后代实生苗具体是经过有性生殖还是无融合生殖产生，尚需进一步试验验证。

4 结论

平邑甜茶授粉后柱头上的花粉萌发率低，只有极少数花粉可以生长到花柱下端，人工授粉有助于提高坐果率和单果重，提高种子的饱满程度和形成率。自然状态下平邑甜茶无融合生殖率约为47.30%，后代实生苗大部分为三倍体，有少部分二倍体、四倍体、五倍体和非整数倍体。不同授粉处理的后代实生苗杂种率以自然状态下最高，但花开前去雄授粉套袋处理四倍体杂交苗率显著高于其他处理。平邑甜茶可以进行有性杂交，但生殖机能复杂。

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