小麦冬春性人工低温春化鉴定的研究

冯岳+褚蔚+隋新霞+黄承彦+崔德周+樊庆琦+楚秀生

摘要：本试验旨在筛选适合小麦冬春性室内鉴定的方法和指标，以济麦19、钱交麦、泰山1号、济麦20、中国春为强冬性、冬性、半冬性、偏春性和春性对照，对2014—2016年山东省区试的108份小麦品种进行冬春性室内春化鉴定、田间错期春播鉴定和分子鉴定。通过对幼苗习性、抽穗率、抽穗期等指标的观察确定小麦冬春性室内鉴定的可靠指标，提出采用室内鉴定法评判品种的冬春性，并初步建立了小麦品种室内春化鉴定法检测小麦冬春性的检测指标体系：春性、偏春性、半冬性、冬性和强冬性小麦品种在2℃条件下完成春化所需时间分级分别为0 d、0 d40 d。

关键词：小麦；冬春性；人工低温春化鉴定法

中图分类号：S512.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）01-0009-07

Abstract To screen out the identification methods and indicators for winterness and springness of wheat indoor， we used Jimai 19， Qianjiaomai， Taishan No. 1， Jimai 20 and Chinese Spring as the control of strong winterness， winterness， semi-winterness， partial springness and springness wheat， respectively， and 108 wheat varieties from Shandong Regional Test during 2014-2016 were selected to identify the winterness and springness through indoor identification， intermission spring seeding in field， and molecular identification. Through the observation of seedling habits， heading rate and heading period， we confirmed the reliability indicators for identifying winterness and springness of wheat indoor， proposed the indoor identification method of winterness and springness of wheat varieties， and preliminary established the identification system using the artificial vernalization method to determine the winterness and springness of wheat indoor. The indentification system was as follows： under the condition of 2℃， the time for springness， partial springness， semi-winterness， winterness， strong winterness wheat varieties to complete vernalization were 0 d， 0 d40 d， respectively.

Keywords Wheat； Winterness and springness； Artificial vernalization method

小麦是我国的第二大粮食作物[1]。小麦对温光反应的发育特性决定了其对不同区域的适应性。春化作用特性是小麦品种的重要性状，直接影响着小麦品种的种植范围和利用效率。小麦品种的冬春性不同，其抗寒性、早熟性、丰产性往往存在较大差异，生产上常因忽略品种冬春性问题而造成重大损失，因此对小麦冬春性做准确科学的鉴定具有重要意义。

从20世纪初苏联科学家Lysenko提出春化理论[2]以来，国内外学者从形态学、生理学、分子生物学等方面进行深入探讨，提出过诸多冬春性鉴定方法与指标，主要包括：形态观察法[3，4]、田间春播法[5]、综合顺序分类法[6]、生理因子鉴定法（生长点变化、赤霉烯酮含量变化等）[7-9]、分子生物学方法（分子标记鉴定法）[10]等。实践中，由于鉴定目的和要求不同，所采用的鉴定方法也不同。目前应用最广的小麦冬春性鉴定方法为综合顺序分类法（国家标准）[11]。但該方法对田间自然条件依赖性强，而不同年份、不同区域间温度、光照、降水等存在较大差异，使得该鉴定存在时间空间的局限性，需进行多年多地试验才能得到更加准确的结果，工作量大，周期长，重复性差。因此，探索一种可操作性强、限制因素少、重复性强的小麦冬春性鉴定方法和指标成为现实迫切需求。本研究以2014—2015、2015—2016两年度山东省小麦区试品种为试材进行小麦冬春性室内鉴定，并将其结果与田间春播鉴定、分子生物学鉴定的结果进行比较，旨在研究出稳定可靠的小麦冬春性室内鉴定指标和技术标准。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材为2014—2016年山东省小麦区试材料108份。强冬性、冬性、半冬性、偏春性和春性对照品种分别为济麦19、钱交麦、泰山1号、济麦20和中国春。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦冬春性室内鉴定 试验在山东省农业科学院春化室和智能日光温室内进行。每品种选饱满籽粒140粒，70%酒精消毒处理2 min，去离子水冲洗干净，平均分为7份，每份20粒，置于垫有吸水滤纸的培养皿中，25℃暗培养箱中催芽48 h。

将催芽后的小麦籽粒分批次置于2℃低温春化室中处理0、10、15、20、25、30、40 d（光照均为24 h/d），每隔2～3 d加水5 mL以保证培养皿内滤纸湿润，水温应与春化室温度相近以避免温差太大影响小麦幼苗生长。

将分批低温春化处理后的幼苗移栽至智能日光温室内的花盆中，温室设置温度20℃，光照为16 h/d。调查统计小麦品种的苗情苗相及孕穗抽穗时间。统计时间以70 d为限。

1.2.2 冬春性分子鉴定 利用Yan、Fu、Yoshida等[12-19]设计的STS引物，对春化基因Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和Vrn-B4进行分子检测。引物序列见表1。

DNA的提取：用小麦叶片提取基因组DNA，采用北京全式金公司生产的快捷型植物全基因组提取试剂盒提取。

2 结果与分析

2.1 对照品种室内低温春化处理鉴定结果分析

由表2、表3中5份已知标准品种可以看出：随着春化时间的延长，冬性品种的抽穗率呈逐渐增加趋势，且同一品种的抽穗率也随着春化时间的增加而增加。春性品种中国春幼苗习性为半匍匐，且在春化0 d时也能正常抽穗；偏春性品种济麦20幼苗习性为直立，春化0 d时抽穗率为35%，且麦穗较正常穗小、结实率低，春化10 d时抽穗率达到80%，可见济麦20至少需要10 d的低温春化时间才能正常抽穗；半冬性品种泰山1号在春化20、25、30 d和40 d处理下幼苗习性为直立，而春化0、10、15 d时均为匍匐，且春化20 d及以上处理抽穗率均为80%以上，春化0、10 d时不抽穗，春化15 d时抽穗率为30%，由此可见泰山1号至少需要20 d的低温春化时间才能正常抽穗；冬性品种钱交麦在春化30、40 d时幼苗习性为直立，在少于30 d春化处理下幼苗习性为匍匐，春化30 d和40 d时抽穗率分别达到80%和85%，在少于30 d的春化条件下不抽穗，可以得出，钱交麦至少需要30 d的低温春化才能正常抽穗；强冬性品种济麦19幼苗习性仅在春化40 d时为直立，其余处理为匍匐，春化40 d的抽穗率达到90%，而春化30 d的抽穗率仅为40%，春化30 d以下处理均不抽穗，因此强冬性品种济麦19正常抽穗至少需要低温春化40 d。由此可以得出结论，以抽穗率80%以上视为该品种完成春化，在苗期2℃春化条件下，春性小麦品种（中国春）不需要低温春化即可正常抽穗；偏春性小麦品种（济麦20）完成春化至少需要10 d；半冬性小麦品种（泰山1号）完成春化至少需要20 d；冬性小麦品种（钱交麦）至少需要30 d时间完成春化；强冬性小麦（济麦19）完成春化则需要40 d以上。依据以上规律，全部品种室内鉴定结果见表4。

2.2 对108份小麦品种不同冬春性鉴定方法所得结果的比较

采用室内低温春化鉴定法、综合顺序分类法和分子标记鉴定法对108份小麦品种进行冬春性鉴定，结果见表4。从中看出，108份供试品种中，有101份三种方法的鉴定结果相一致；7份供试材料出现了综合顺序分类法与室内低温春化法鉴定结果不符现象，但这7份供试材料的分子标记鉴定结果更支持室内低温春化法。因此，在人控低温春化条件下进行小麦冬春性鉴定更加准确可靠，且具有易掌握、可操作性强的优点，关键是可以准确确定待测小麦品种正常抽穗开花所需的临界低温春化时间（最短春化时间）。

2.3 对7份品种冬春性鉴定结果存在差异的原因分析

针对泰麦1918、11WST045、菏麦0605、鑫麦803、博农麦8号、烟农194、岱麦3166共7份品种综合顺序分类法与室内低温春化法鉴定结果不相符的原因进行分析，可以看出，鉴定结果的差异与田间鉴定法依赖田间自然低温春化有关。综合顺序分类法鉴定小麦品种的冬春性需在平均温度达到3℃、7℃和10℃的条件下进行分期播种，以7℃及30%抽穗率作为划分冬性和春性的标准，以3℃及0、5%和20%抽穗率作为划分强冬性、冬性和半冬性的标准，该标准的确立地点是河南省，该省大部分属于温带季风气候，南部小部分属于亚热带季风气候，四季分明，春季回温缓和；而济南市气候特点为春季气温回升快，日差较大。根据济南地区的气候条件，平均气温达到3℃、7℃和10℃通常在2月27日、3月6日和3月13日，但不同年份之间存在不同程度的差异。如图1所示，4年里济南地区2月27日—3月6日和3月6日—3月13日的积温， 2012年3月6日—3月13日积温明显低于正常年份的65℃，其积温更接近常年2月27日—3月6日之间的积温（气温信息来自中国气象网），这可能是泰麦1918、11WST045鉴定出现误差的原因。2013年2月27日—3月6日的积温均明显高于其它年份，高温可能通过降低待测小麦的春化程度进而影响到待测小麦的鉴定结果，使得菏麦0605、鑫麦803鉴定出现误差。如图2所示，虽然2015年积温条件正常，但2015年3月济南气温变化波动明显，其中3月8日—3月10日出现了较强降温，较大的温差可能是博农麦8号、烟农194、岱麦3166鉴定误差的原因。由此可以看出，由于不同地区、不同年份间气候的差异，使得依赖自然低温条件春化的综合顺序分类法出现了不同程度的误差，因此为得到更加准确可靠的鉴定结果，需要进行多年多地的鉴定。

2.4 小麦冬春性人工低温春化鉴定体系

从本研究结果看，单株抽穗率大于80%视为正常抽穗，正常抽穗所需最低春化时间视为该品种抽穗的临界春化时间，则偏春性、半冬性、冬性和强冬性小麦品种的临界春化时间可分别确定为0 d40 d。

3 讨论与结论

本试验用人工低温春化法、综合顺序分类法和分子标记鉴定法，对2014—2016年的108份山东省区域试验品种進行了冬春性鉴定，3种方法的鉴定结果基本相符，但仍存在一些鉴定方面的误差，这些误差，也从不同层面、不同程度反映出不同冬春性鉴定方法的优势及存在的不足。

3.1 綜合顺序分类法

综合顺序分类法，是2009年张灿军[6]提出的一种冬春性鉴定方法，目前应用最广。该方法是通过调节播种时间、利用春季气温回升过程中自然条件的低温变化，对待测小麦品种进行不同程度的低温春化处理，从而达到对待测小麦品种的春化习性进行分级分类的目的。该方法的优点是适应范围广：我国小麦种植区域气候类型多为温带大陆性气候、温带季风气候，该气候具有四季分明、气候温和的特点，这就决定了通过分期播种，利用自然条件下春季回温缓慢的特点可以有效地鉴定小麦品种的春化特性。该方法也有如下局限性。第一，春化过程中温度控制的局限性：正常年份下，气温较往年变化波动小，综合顺序分类法可以完成小麦冬春性的鉴定；但极端天气（倒春寒）或者温度变化波动较大（暖冬）的天气条件，会对鉴定结果有很大影响。例如2013年济南地区气温回升快、春季积温明显高于往年，2015年3月3日和3月9日出现了大幅度的降温，这就可能使得依靠自然气温回升的冬春性鉴定出现误差。第二，鉴定时间的局限性：该方法依靠自然低温完成小麦的春化过程，这就要求其鉴定过程对季节和时间有严格的要求，每年只能完成1次鉴定。第三，没有考虑到光周期对抽穗率的影响：综合顺序分类法因自然条件的限制，无法对春化过程中光周期的条件进行调控。因此，该方法需要进行多年多地试验才能得到更加准确的鉴定结果。

3.2 分子标记鉴定

截止目前的研究，已知的4份与小麦春化反应有关的基因中，主效基因Vrn-1位于小麦的A、B和D染色体组的第5染色体长臂上，分别命名为Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1[12-17，20]。小麦春化基因的显隐性受春化基因的2份位点控制，即基因启动子（promoter）和第一份内含子（intron）部位。Yan和Fu等[12-17]根据显性与隐性等位基因在Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1位点序列差异，设计了特异性引物，能有效地对Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和Vrn-B4的不同变异类型和显隐性进行辨别和区分。利用分子标记鉴定方法，能有效地鉴定待测品种的春化基因型，不受时间空间的限制且准确性高。但根据对小麦春化现象的研究，春性性状相对于冬性性状为显性，春性小麦品种至少含有一份以上的VRN1基因，而冬性小麦品种其VRN1春化基因型均为隐性纯合；但冬性小麦却与其基因型的纯合性不同，小麦冬性性状存在着偏春性、半冬性、冬性和强冬性等不同的性状类型。小麦冬春性基因型和表现型的特殊性意味着仅依靠分子标记鉴定法只能对小麦品种的冬性和春性进行有效鉴定，很难就冬性性状的强弱进行有效区分。

3.3 人工低温春化鉴定

通过两年的系统研究，初步建立了人工低温春化鉴定的指标体系。人工低温春化鉴定方法，通过对低温春化温度、时间及后期生长过程中温度、光照时间的控制，通过抽穗率指标对小麦冬春性类型进行划分，能有效地对不同小麦品种通过春化所需的低温时间进行划分，排除了自然低温春化过程中温度变化的影响以及后期生长过程中低温再春化和特殊天气对鉴定结果造成的影响，具有准确度高、针对性强的特点。利用人工低温春化法进行鉴定由于所有的鉴定过程均在室内完成，能够实现一年多次鉴定且鉴定速度较快。但该鉴定法需要人工低温春化室和人工智能气候温室等，鉴定成本较高。

综上所述，小麦冬春性鉴定工作应根据不同条件不同要求采取不同的鉴定方法或者采用多种鉴定法相结合以得到更为准确的鉴定结果。

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