乌鳢不同组织DNA提取研究

2018-02-03肖畅赵岩肖明松

现代农业科技 2018年1期

肖畅+赵岩+肖明松

摘要 [目的]研究乌鳢的肌肉、肝脏、肾脏、尾鳍、鳞片、肠、鳃盖、鳃等组织的DNA提取。[方法] 利用酚-氯仿法提取乌鳢的肌肉、肝脏、肾脏、尾鳍、鳞片、肠、鳃盖、鳃等组织的DNA，采用紫外分光光度计法、琼脂糖凝胶电泳法和PCR扩增法检测提取的DNA质量。[结果] 结果表明，不同组织的DNA含量不同（0.370～0.975 μg/μL），其中肌肉、肝脏、肾脏和肠等组织DNA质量较高，而尾鳍、鳞片、鳃和鳃盖等组织DNA质量较差。[结论] 乌鳢的肌肉、肝脏、肾脏和肠等组织提取的DNA可用于后续的分子生物学研究。

关键词乌鳢；DNA；酚-氯仿法

中图分类号 Q95-336 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）01-0223-02

Study on DNA Extraction from Different Tissues of Ophiocephalus argus Cantor

XIAO Chang 1 ZHAO Yan 2 XIAO Ming-song 2

（1 2 Classes High School，Hefei 168 Middle School，Hefei Anhui 230000； 2 College of Life Science，Anhui Science and Technology University）

Abstract [Objective] To research DNA extraction from the muscles，liver，kidney，caudal fins，scales，intestines，operculum and gills of Ophioc-ephalus argus Cantor.[Methods]Genomic DNA from the muscles，liver，kidney，caudal fins，scales，intestines，operculum and gills of Ophiocephalus argus Cantor was extracted by phenol-chloroform.DNA concentration of various tissues of Ophiocephalus argus Cantor calculated by ultraviolet spectrophotometer tests and agarose gel electrophoresis.Mitochondrial DNA control region sequence of Ophiocephalus argus Cantor was amplified by PCR.[Results] The DNA concentration of different tissues of Ophiocephalus argus Cantor ranged from 0.370 to 0.975 μg/μL.The quality of DNA in muscle，liver，kidney and intestine was higher than that in caudal fin，scales，gills and gill cover.[Conclusion]DNA extracted from the muscle，liver，kidney and intestine of Ophicephalus argus Cantor can be used in subsequent molecular biology research.

Key words Ophiocephalus argus Cantor；DNA；phenol-chloroform extraction

乌鳢（Ophiocephalus argus Cantor），俗称黑鱼、才鱼、乌鱼等，是鳢科鱼类中个体大、生长快、经济价值高的名贵经济鱼类[1]。乌鳢肉质细嫩，口味鲜美，且营养价值颇高，因而在国内外市场深受欢迎，是人们喜爱的上乘菜肴。此外，乌鳢还具有去瘀生新、滋补调养、健脾利水的医疗功效。病后、产后以及手术后食用，有生肌补血、加速愈合伤口的作用[2]。除高原地区外，乌鳢主要分布在长江流域和黑龙江流域的大部分地区[3-4]。近年来，由于水利工程、产卵场的破坏、环境的污染及人为的滥捕等使野生乌鳢自然资源日渐衰竭，已经不能再形成优势种群，甚至有些大型水域的乌鳢已经灭绝，对乌鳢渔业资源造成了难以逆转的破坏[5-6]。为了保护和开发野生乌鳢种质资源，了解和研究其遗传特性，分子生物学技术成为研究其遗传特性和品种改良的有力工具之一，而提取高质量的乌鳢基因组DNA 是进行各种分子生物学研究的基础和前提。

1 材料与方法

1.1 试验材料

試验乌鳢取自安徽省凤阳县燃灯水库，数量为2尾，鱼龄2龄左右，体长25 cm左右，体重0.33～0.41 kg，活鱼运回实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 模板DNA的制备。将2尾活鱼解剖，分别取乌鳢的肌肉、肝脏、肾脏、尾鳍、鳞片、肠、鳃盖、鳃等组织（质量为80～100 mg）。首先将研钵和石英砂预冷，然后将鳞片、鳃、鳃盖、尾鳍等难裂解组织剪碎后放入研钵中，加入适量的石英砂，置于冰上充分研磨过滤，再将滤液转移到离心管中，而肌肉、肾脏等易裂解组织剪碎后即可放入离心管中，DNA提取采用酚-氯仿法[6]。

1.2.2 DNA浓度的测定。取待测DNA 15 μL倒入5 mL离心管中，用TE缓冲液稀释100倍混匀待测。将待测液分别放在260 nm和280 nm处测量其吸光值。对比不同组织来源的OD260/OD280值，判断DNA的纯度和浓度。若OD260/OD280值为1.8±0.1，则DNA较纯；若OD260/OD280>1.8，说明样品中有RNA存在；若OD260/OD280<1.6，则说明样品中DNA不纯。DNA浓度（μg/μL）=50×OD260×稀释倍数÷1 000，（OD260值相当于50 μg/mL DNA）。endprint

1.2.3 DNA 检测和PCR扩增。待测DNA样品用1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测其DNA 的完整性，并将DNA样品置于-20 ℃冰箱保存备用。用于PCR扩增的2条引物为乌鳢线粒体控制区部分片段引物：L20110518（5-ACC CCTAAC TCC CAA AGC-3）和H20110518（5-ATC TTA ACA TCT TCA GTG-3）[6]，由上海生工生物工程技術有限公司合成。PCR 反应体系为30 μL，其中含10×buffer反应缓冲液3.0 μL，3 μL dNTP （2.5 mmol/L），0.4 mmol/L引物，0. 25 μL Taq酶（大连TaKaRa公司），模板DNA 1.0 μL，加灭菌蒸馏水至30.0 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用1.0%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，电泳结果在化学发光凝胶成像系统（ChemiDoc XRS）中拍照、保存。

2 结果与分析

2.1 紫外分光光度检测结果

利用紫外分光光度计法对2尾乌鳢不同组织DNA溶液共15个样品进行检测，并根据吸光值计算DNA的浓度，具体见表1。一般认为样品的OD260/OD280值的正常范围在1.65～1.87之间，若比值>1.80，表明样品中可能有RNA存在，若比值<1.80，表明样品中可能含有蛋白质或苯酚等杂质。由表1可知，乌鳢不同组织DNA的OD260/OD280的平均值为1.673，属于正常水平。其中肌肉组织DNA的OD260/OD280的纯度较高，其平均比值为1.811 5。鳃盖OD260/OD280的值最小（1.423），表明鳃盖DNA很不纯，可能含有较多的蛋白质或苯酚等杂质。不同组织DNA浓度为0.370～0.975 μg/μL，平均DNA浓度为0.722 μg/μL。其中肌肉组织DNA浓度最高，平均浓度达到0.960 μg/μL，肝、肾脏和肠等组织的DNA浓度相对较高（0.830～0.960 μg/μL）。而鳃盖的DNA浓度最低，仅有0.370 μg/μL。

2.2 DNA提取后的电泳检测结果

利用琼脂糖凝胶电泳法对2尾乌鳢的肌肉、肝脏、肾脏、尾鳍、鳞片、肠、鳃盖、鳃等组织提取的DNA进行电泳，结果见图1。由图1可知，肌肉、肝脏、肾脏和肠组织的电泳条带明亮清晰，基因组DNA较完整，而尾鳍、鳞片、鳃盖和鳃组织提取的DNA电泳条带模糊暗淡，DNA质量都较低。这表明酚-氯仿法提取乌鳢肌肉、肝脏、肾脏和肠等组织的DNA效果好、质量较高，而尾鳍、鳞片、鳃盖和鳃组织中提取的DNA效果差、质量低。

2.3 DNA PCR扩增结果

根据电泳检测结果，对乌鳢肌肉、肝脏、肾脏、尾鳍、肠和鳃等组织进行PCR扩增，电泳结果见图2。由图2可知，除了尾鳍组织条带模糊外，其他组织DNA经PCR扩增后均能得到非常整洁明亮的DNA条带，表明从肌肉、肝脏、肾脏和肠组织中提取的DNA纯度很高，提取效果很好，可为后续相关的分子生物学研究的基础。

3 结论与讨论

DNA作为分子生物学研究的基础，其提取方法多种多样。酚-氯仿抽提法、甲酰胺解聚法、异丙醇沉淀法、试剂盒快速抽提法等均能有效获得DNA[7-8]。本试验利用酚-氯仿法提取乌鳢不同组织的DNA，由于氯化钠、醋酸钠、异戊醇和RNA酶等试剂的使用，既降低了试验成本又简化了试验流程。通过对乌鳢肌肉、肝脏、肾脏、尾鳍、鳞片、肠、鳃盖、鳃等组织提取的DNA紫外分光光度检测和凝胶电泳检测结果比较可知，肌肉、肝脏、肾脏和肠等组织的DNA提取效果较好，而尾鳍、鳞片、鳃和鳃盖等组织的DNA提取效果较差。导致这样的结果可能有以下原因：一是肌肉等组织材质柔软易被裂解，而尾鳍、鳃盖等组织比较坚硬，裂解困难；二是尾鳍、鳃盖等组织在裂解前必须研磨，这一过程会导致DNA有损失和降解，另外，还易受人为因素影响，如研磨不够充分等；三是在研磨尾鳍、鳃盖等组织时，需要加石英砂，但石英砂可能会阻塞滤纸的滤孔而影响到细胞内容物的过滤[9-13]。因此，为了获得更好的试验效果，在试验前需进行预试验，建立石英砂、细胞裂解液、蛋白酶K溶液的不同质量或浓度梯度，以确定最适用量。

4 参考文献

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