剩余污泥处理中沙门氏菌的耐药性及其抗性传播机制综述

孙书民，邢美燕，马小杰，杨 健

（1.同济大学环境与科学工程学院长江水环境教育部重点实验室；2.上海市城市建设设计研究总院，上海 200092）

随着经济的快速发展和城市化进程的不断推进，我国每年需要处理大量的生活污水和工业废水。2013年，我国处理城镇污水产生的污泥达到2 300～3 700万t（按污泥的含水率80%计算），并且有逐年增加的趋势[1]。随着污泥产量的大量增加，其带来的环境安全风险逐年增大，尤其是剩余污泥中含有的病原菌，如在抗生素药物滥用下产生的耐药菌，在污泥利用最积极的出路——污泥农用中对土壤及农作物会产生严重的安全问题，甚至会对人类健康带来威胁。

在剩余污泥处理处置的各类病原菌中，沙门氏菌尤其值得关注，作为一种典型的致病菌，感染沙门氏菌轻者会引起人头疼、呕吐、全身乏力等，重者会出现抽搐和昏迷的症状，甚至会致死[2]。沙门氏菌属肠杆菌科、革兰式阴性肠道杆菌，是一群形态、培养、生化反应和抗原构造相类似的重要肠道菌。沙门氏菌广泛分布于自然界，是引起食物中毒的重要病原菌[3]。

关于沙门氏菌的耐药性，一方面，抗菌药物在人类和动物疾病防治屮的大量使用，使得沙门氏菌对抗菌药物的耐药性快速增长，特别是多重耐药性，据报道全世界抗生素的使用量每年增加100 000～200 000 t[4]；另一方面，人们在河流、地下水、土壤等多种自然环境中检查到了耐药性沙门氏菌及耐药基因，其中，生活污水及其处理终端城市污水处理厂是环境中耐药沙门氏菌及耐药基因的主要汇集地，污水厂处理的污水和排出的活性污泥成为耐药性沙门氏菌的主要来源[5]。

近年来研究表明，沙门氏菌耐药性的出现不仅与菌株长期接触的环境含有多种抗菌药物有关，还与其自身毒力基因的纵向和水平传播存在一定关系，因此人们需要了解抗性的传播。但是，目前关于沙门氏菌的耐药性研究主要集中在食品和养殖场领域，关于剩余污泥的研究较少，实际上，处理终端城市污水的污水厂作为环境中多种抗生素及耐药细菌和基因的汇集地，其中耐药性的分布、排放和迁移传播等各方面更应该受到人们的关注。鉴于此，本文主要围绕沙门氏菌的耐药情况，综述了沙门氏菌的主要耐药及抗性传播机制，以期对更好地处理剩余污泥中的耐药性沙门氏菌提供参考，减轻污泥后续农用的风险。

1 沙门氏菌耐药机制的综合性描述

1.1 灭活酶和钝化酶引起沙门氏菌耐药

由于城市污水处理厂汇集了多种含不同抗生素的废水（主要是生活废水和医院废水等），并含有丰富的营养物质及优越的细菌生存条件，所以细菌长期处于富含抗生素的污水污泥里，很容易被诱导而产生灭活酶或钝化酶，这两种酶可以作用于抗生素使其失活，从而使抗生素无法正常发挥作用，进而产生耐药性[6]。

目前研究发现，随着抗生素的大量使用，细菌产生的灭活酶或钝化酶主要是β-内酰胺酶。沙门氏菌产生β-内酰胺酶是对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制，而β-内酰胺酶主要包括AmpC头孢菌素酶和超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）：AmpC头孢菌素酶是由沙门氏菌的染色体和质粒共同介导的，但产生耐药性的酶主要由质粒介导，其作用于头孢菌素类抗生素使其失去活性而产生耐药性；ESBLs由质粒介导产生，其作用于头孢菌素类、青霉素类等抗生素使其失活进而产生耐药性，携带ESBLs基因的耐药质粒可以在不同菌种或不同种属间传播，因此新型超广谱β-内酰胺类抗生素耐药性的机制尤其值得人们注意。

同时，研究发现沙门氏菌可表达TEM、SHV、PER和CTX-M酶等多种ESBLs，因此这给掌握剩余污泥中沙门氏菌的耐药性增加了难度[7]。通过研究污水厂产生的活性污泥，人们发现，blaTEM是活性污泥中β-内酰胺抗生素抗性的唯一机制，而blaTEM基因编码可以破坏β-内酰胺抗生素结构的β-内酰胺酶，这为减轻活性污泥中沙门氏菌的耐药性提供了一种新的方法[8-9]。

沙门氏菌对氨基糖苷类抗生素产生耐药的主要机制是可以产生钝化酶，沙门氏菌通过分泌这些酶，修饰并改变氨基糖苷类药物的结构，使得钝化后的药物不能进入膜内与靶核糖体结合，从而产生耐药性。研究发现，氨基糖苷类药物修饰钝化酶主要分为三类：乙酰转移酶（AAC）、腺苷酸转移酶（AAD）和磷酸转移酶（APH）[10]。其中，AAC作用于氨基糖苷类及酰氨醇类抗生素，可以将氨基酸乙酰化；AAD和APH可作用于氨基糖苷类抗生素，其分别可以将羟基（-OH）腺化和磷酸化。随着技术的不断进步，编码氨基糖苷类药物修饰酶的基因会不断在污水和剩余污泥中被发现，掌握这些基因编码的工作原理，对于减轻剩余污泥中沙门氏菌耐药性的传播有至关重要的作用。

1.2 细菌外排泵作用引起沙门氏菌耐药

药物外排泵引起细菌耐药主要分为两种：染色体介导的多重药物外排泵和染色体或质粒介导的特异性药物外排泵。研究发现，许多细菌可以通过外排泵系统将进入胞内的抗菌药物泵出胞外，从而使菌体内药物浓度降低而导致耐药。目前发现鼠伤寒沙门氏菌的主要外排泵为AcrAB系统[11]。除此之外，沙门氏菌外排泵系统还有arcAB、arcEF、arcD、mdtABC、mdtK、mdsABC、mdfK、emrAB、macAB等9种形式[12]。

在沙门氏菌的外排泵中，最重要的是RND家族的AcrAB-ToLC外排泵，因为其可介导包括有机溶剂、染料（EB）、抗菌药物（如四环素、头孢菌素、氟喹诺酮类）等在内的多重耐药[13]。研究显示，AcrABToLC外排泵系统中的染色体的acrAB主要受基因marRAB调控，编码药物外排泵AcrAB，而MarA与其他包括SoxS和Rob在内的激活子一起调控marRAB基因的表达，在污水厂中检出了较高浓度的多重耐药基因MarA[14]。另外，外膜蛋白TolC是AcrAB的外排通道，是保持对抗生素耐受所必需的。MarA为正调控蛋白，其可以增强acrAB和TolC表达，使更多的胞内物排出菌体，细菌的耐药性增强。据报道，沙门氏菌对四环素、氨苄青霉素、氯霉素、三甲氧苄氨嘧啶等的多重耐药性均与主动外排系统AcrAB有关[15]。

1.3 细菌生物膜改变引起沙门氏菌耐药

细菌生物膜改变也可以引起沙门氏菌的耐药性，其主要通过以下3个方面影响：OprD或CarO特异通道蛋白表达减低或缺失；OmpF或OprF等膜孔蛋白表达减低或缺失；外膜脂多糖脂改变。由于污水和污水处理厂产生的剩余污泥中含有各种抗生素药物，细菌在长期接触药物的情况下，可以引起菌体细胞膜孔蛋白丢失，从而导致细胞膜通透性下降，引起低度耐药。

另外，细菌在抗生素药物的长期作用下，可通过自身产生的胞外多糖形成将自身包绕的细菌生物被膜，细菌生物被膜可以通过减少抗菌药物渗透使抗菌药物水解，从而使菌体产生耐药性。同时，生物被膜的形成过程会影响编码抗生素耐药、代谢调节和膜转运等功能的相关基因，从而导致菌株产生高度耐药性[16]。据研究报道，沙门氏菌的耐药性与细胞外膜蛋白（OMP）密切相关，有些血型的沙门氏菌会发生基因突变而降低细胞外膜蛋白的含量，从而使沙门氏菌对超广谱β-内酰胺类抗菌素的敏感性降低，进而引起细菌的耐药性[17]。

同样，研究发现具有生物被膜的沙门氏菌对多种抗生素可以产生耐药性[18]。尽管细胞膜通透性下降不是沙门氏菌的主要耐药机制，但是它与主动外排系统所产生的协同作用会导致沙门氏菌对四环素类等抗菌药产生高度的耐药性，所以沙门氏菌的生物膜改变引起的耐药性在剩余污泥的处理中会越来越受到关注。

1.4 基因突变引起沙门氏菌耐药

沙门氏菌会通过基因突变使其表达产物的空间构型和理化性质变化，最终使药物不能识别而产生耐药性。抗生素作用靶位改变引起的耐药性的类型主要有：质粒或染色体介导的16SrRNA甲基化酶改变；质粒或染色体介导的23SrRNA碱基突变或甲基化酶改变；染色体介导的DNA促旋酶和拓扑异构酶改变。

喹诺酮类抗菌素主要是通过对DNA拓扑异构酶Ⅱ（又称旋转酶，包括GyrA和GyrB）和拓扑异构酶Ⅳ（ParC和ParE）的结合和抑制而导致耐药。DNA拓扑异构酶Ⅱ由GyrA和GyrB2个亚基组成，GyrA的点突变一般在革兰氏阴性菌株耐喹诺酮类药物的机制中占主导地位。GyrA的突变会因微生物的不同而有所差异，在沙门氏菌中，GyrA的喹诺酮耐药决定区（QRDR）位于GyrA蛋白第67（Ala）和106（Gln）氨基酸残基之间（第199～318个碱基），最常发生突变在Ser-83，该位置通常突变为Phe、Tyr或Ala，在Asp-87位置常突变为Gly、Asn或Tyr，使沙门氏菌产生对于喹诺酮类和氟喹诺酮类抗菌素的耐药性[19]。

在研究活性污泥中的抗生素耐药性时，人们发现了qnrD喹诺酮抗生素耐药的唯一机制，qnrD编码可导致在氟喹诺酮类靶向的DNA促旋酶和DNA拓扑异构酶IV发生突变[20]。另外，通过研究印第安纳沙门氏菌对喹诺酮或氟喹诺酮药物耐药性，人们发现，印第安纳分离株中都出现了GyrA和ParC突变，在83和87位点出现GyrA突变，主要包括S83F、D87G和D87N，而在57、72和80位出现ParC突变，主要包括S80R、T57S和C72G[21-22]。随着分子生物学检测手段的普及，关于基因突变引起的耐药性会越来越引起人们的重视。

2 沙门氏菌耐药性的传播机制

质粒、转座子和整合子等可移动基因元件可携带一种或多种耐药基因，通过水平转移的方式在沙门氏菌种内或菌种间传播。基因的水平转移是剩余污泥中耐药性沙门氏菌传播、转移的重要途径之一，其可导致沙门氏菌耐药谱拓宽，耐药性增强。所以，掌握沙门氏菌耐药性的传播机制，对于控制和降低剩余污泥中的耐药性沙门氏菌至关重要。目前在污水污泥方面关于沙门氏菌耐药性的传播机制研究较多，主要从携带耐药基因的载体包括转座子、质粒、整合子等方面进行研究。

2.1 转座子介导的耐药性传播

转座子存在于多种生物的基因组中，是连续性的、可移动的基因片。转座子能够携带耐药基因在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自由移动，因而可造成不同菌种甚至不同菌属间传播耐药基因，导致耐药性的传播[23]。在众多转座子中，Tn3系列的复制转座子是负责在革兰式阴性菌中传播抗生素抗性基因的主要系列[24]。转座子发生转座作用时有一个普遍特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）的DNA重复序列，人们称之为靶序列，它可以使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。

另外，有研究报道了携带armA、ant3、sul1和dfxII基因的转子Tn1548和携带blaCTX-M-3基因的IncL/M质粒共同介导多种抗生素耐药性并在多种肠杆菌间的传递[25]。转座子介导的耐药性传播是细菌产生多重耐药性的机制之一，清楚了解转座子的作用机制对于控制沙门氏菌的多重耐药性是很重要的。

2.2 质粒介导的耐药性传播

质粒（Plasmid）是细菌拟核DNA外的遗传物质，是可以独立于染色体外、能够自我复制的DNA，其编码的基因功能可赋予细菌毒性和耐药性等特殊的生物学性状。质粒在同种属或不同种属革兰氏阴性菌基因的转移中起着主要作用，其通过结合、转化和转导等方式使携带的耐药质粒在细菌间传播。由质粒携带耐药基因进行扩散是沙门氏菌产生耐药的重要机制，也是耐药基因传播的主要途径。

很多耐药基因存在于细菌的质粒中，迄今为止在污水厂中发现多种携带耐药基因质粒的载体，包 括 pB2/pB3、pB4、pB10、pTB11、pRSB101、pRSB105、pRSB107、pRSB111、pGNB1、pGNB2等，这些质粒可携带对多种抗生素有抗性的耐药基因[26-31]。沙门氏菌耐药质粒除以接合和转化进行转移外，还可通过转导进行散播，已知具普遍转导能力的温和型噬菌体ES18和PDT17（λ噬菌体的P22类群）在沙门氏菌里普遍存在[32]。据报道，大多数从污水处理厂的活性污泥中分离出来的质粒都属于IncP-1α和IncP-1β不兼容组，这类质粒具有广泛的宿主范围，并且具有高遗传率及各种对抗生素药物的抗性[33-34]。

通过PCR扩增的方法研究从污水厂污水中分离出的阳性肠杆菌编码β-内酰胺酶时，人们发现，编码β-内酰胺酶的基因主要是bla基因，而菌株中大部分编码β-内酰胺酶的基因都是由质粒介导的[35]。另外，人们也从土耳其的鼠伤寒沙门氏菌分离株中的血清中鉴定出编码β-内酰胺酶的基因主要是bla基因，这也证实了质粒介导的耐药性[36]。从动物和人类多重耐药、头孢菌素类耐受沙门氏菌分离株检测到携带CMY-2型β-内酰胺酶的质粒[37]。相似的研究均表明，质粒介导的抗生素耐药性通过接合作用可以在细菌抗性的产生和播散中以较高的频率传递，并起着主导作用[38]。由此可见，这些质粒独立地通过可移动遗传成分进行水平转移获得了相似的耐药基因。

2.3 整合子介导的耐药性传播

整合子（Integron）是细菌菌体屮的一个具有捕获外源基因并将其转变为功能性基因的表达単位，其主要存在于细菌染色体、质粒或转座子上，可引起耐药性的广泛传播。由于其结构、功能与转座子、整合型噬菌体及结合型质粒相似，可在染色体质粒及转座子之间移动，故其可以归为可移动基因元件。由于整合子基因盒中的基因大多为耐药基因，因此整合子与细菌耐药性的表达及传播密切相关，以造成细菌的多重耐药[39]。整合子基因盒可通过整合子的整合酶催化而特异性地结合于整合子上，并通过整合子上的启动子作用得以表达，故又称基因盒-整合子系统[40]。多重耐药整合子中可含多达7种基因盒，其可以使耐药菌株的数量和耐抗生素的种类增多[41]。

为了进一步研究沙门氏菌多重耐药性与整合子基因盒之间的关系，人们对整合子PCR产物进行了DNA测序。测序结果显示：Ⅰ类整合子携带了dfrA1、sat2和aadA1基因盒，其分别编码对磺胺类、链丝霉素和氨基糖苷类抗生素药物的耐药性[42]。国外的一些研究也发现，编码对链丝霉素和甲氧苄氨嘧啶的耐药性基因盒最为常见，其中以dfrA1-aadA1基因盒组合最常见[43]。

另外，从挪威医院废水分离的90株肠炎沙门氏菌有20株（22.2%）含有整合子，并且其都携带耐药基因[44]。研究结果说明，含有甲氧苄氨嘧啶和链霉素抗性基因的整合子通常与多重耐药性肠炎沙门氏菌相关。总之，整合子的发现为进一步阐明沙门氏菌的耐药性特别是多重耐药性提供了新的思路，这对剩余污泥中耐药性沙门氏菌的监测具有实际意义。

2.4 毒力因子引起沙门氏菌耐药

沙门氏菌的感染可以使人类致病，所以近年来，抗菌药物的使用给人类治疗相关疾病带来了显著的效果。但是，随着抗生素等药物的大量及不合理的使用，细菌的耐药性变得越来越严重，这又给人类治疗细菌类的疾病带来新的挑战。因此，人们在掌握了毒力因子会使沙门氏菌具有致病性的同时，也开始探讨毒力因子与沙门氏菌耐药性的关系。

沙门氏菌的毒力因子主要包括脂多糖、肠毒素、菌毛、毒力岛、毒力质粒及毒力基因等。随着人们对细菌耐药机制的深入研究，人们不仅发现了细菌耐药性的出现与菌株长期处于环境中多种抗生素的选择性压力及耐药基因通过质粒或染色体在同种或不同种菌群间的广泛传播或扩散有关，还发现细菌耐药性与毒力之间可能存在一定关系[45]。研究发现，所分离的肠炎沙门氏菌菌株的耐药性尤其是多重耐药性很高，值得注意的是所有分离株都携带invA、sefA、sipA和sopE2毒力基因[46]。此外，在菌株中还观察到17种毒力谱，最常见的毒力谱是VP1（n=17；38.6%），其含有所有毒力基因。据研究报道，污水处理中的SBR工艺可有效去除各种毒力基因，通过SBR工艺的处理，各种毒力基因的浓度从进水的2.2×102～1.2×105copies/100 mL降低到出水的1.4×101～ 3.3×102copies/100 mL[47-49]。随着毒力基因的去除，沙门氏菌的耐药性也会受到抑制。在剩余污泥方面，关于毒力基因对沙门氏菌耐药性传播的研究较少，这也是接下来探索污泥中沙门氏菌耐药性传播的主要方向之一。

3 结语

当今细菌的耐药性已经成为人们关注的热点，特别是类似于沙门氏菌的致病菌在剩余污泥中大量存在，这给污泥的农用带来了难题。所以，在人们大量使用抗生素的影响下，沙门氏菌产生适应性的变异，耐药机制也会变得更加复杂，随着沙门氏菌的耐药机制变得越来越复杂，人们要对沙门氏菌的耐药机制、耐药基因的传播途径等有更加全面复合的研究，这样才能掌握沙门氏菌耐药性的变迁，才能更好地解决污泥中沙门氏菌的耐药性问题，减轻污泥农用的风险，使污泥变废为宝。