山羊痘病毒ORF112基因的克隆与序列分析

豆思远，鄂承钧，郭慧琳，尚立宏，杨 明，陈伯祥

（1.甘肃省动物疫病预防控制中心，兰州 730046；2.甘肃省畜牧兽医研究所，平凉 740000）

山羊痘是由山羊痘病毒（goat pox virus，GTPV）引起的一种急性、热性、接触性传染病，病羊以发热、全身起痘、呼吸道和消化道损伤以及淋巴结肿大为特征［1］。该病的流行不但对当地养羊业的发展和农牧民造成巨大的损失，还影响国际贸易，被OIE列为必须报告的疫病，也列为我国一类动物疫病。

近年来，山羊痘疫情在世界各地尤其东亚地区呈暴发流行态势。山羊痘基因组大小为143～147 kb，共有147个开放阅读框（ORF），编码密度93%，所编码的蛋白质含53～2 027个氨基酸不等［2］。大量研究证实，A27L蛋白是痘苗病毒细胞内成熟病毒粒子（intracellular mature virion，IMV）重要的免疫保护抗原之一。A27L蛋白又称融合蛋白，其能与细胞膜表面的氨基葡聚糖受体结合，介导病毒与细胞的黏附及由病毒引起的细胞融合，参与IMV形成细胞内包膜病毒粒子的过程；还能诱导机体产生高水平的中和抗体［3-5］。基因组学研究证明，GPTV ORF112编码产物与痘苗病毒A27L蛋白同源［6］。因此，笔者等推测ORF112编码产物是GTPV的主要免疫保护性抗原之一，可能在免疫应答中发挥重要作用。为检测该蛋白诱导的特异性免疫应答，本文开展了山羊痘病毒ORF112基因的克隆与序列分析，为建立敏感、快速、准确、简单易行的GTPV检测方法和ORF112蛋白的后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与菌株 山羊痘毒株（GTPV-S-1）由甘肃省畜牧兽医研究所保存，并在原代绵羊睾丸细胞中培养。

1.1.2 主要试剂与载体 T4DNA连接酶、PCR试剂、Takara DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0试剂盒、pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司，SE.DNA kit（OMEGA bio-tek）购自 OMEGA公司；大肠杆菌DH5α 和 BL21（DE3）菌种购自 Solarbio。

1.2 方法

1.2.1ORF112基因的PCR扩增 根据GenBank中收录的GTPV基因序列，遵循引物设计原则，设计一对引物用于扩增ORF112基因，上游引物P1：5’-GTTTTAAATGGACAGAGCG-3’；下游引物 P2：5’-AGATTTAAGTCCTAGTTTTTTG-3’，预期扩增的目的片段大小492 bp。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

取200 μL病毒细胞培养物，用病毒DNA提取试剂盒提取病毒基因组DNA，然后取5 μL病毒基因组DNA为模板，加入 4 μL dNTP 混合物、5 μL 10×PCR buffer、上下游引物各 1 μL、0.25 μL EX Taq 酶，最后补水至50 μL。PCR 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 50 s；55℃ 50 s，72℃60 s，35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃终止反应。PCR产物在10 g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

1.2.2 连接及转化 按照Takara DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0的说明书操作，对PCR产物进行纯化，与pMD18-T载体相连接，转化感受态细胞DH5α。在涂有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，挑选单个菌落接入含氨苄青霉素的LB培养液中，提取质粒DNA样本，经PCR扩增检测后将重组质粒送大连宝生物工程有限公司测序。

1.2.3 序列分析 应用DNAStar、BLAST（NCB I）软件与GenBank登录的相应序列进行比较，分析不同来源山羊痘病毒株ORF112基因核苷酸序列的同源性。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增及初步鉴定

采用引物进行PCR扩增，从山羊痘病毒感染细胞培养物的核酸样本中扩增出1条约500 bp大小的DNA条带，而正常细胞显现阴性反应，与预期大小相符合（图1）。

图1 ORF112扩增产物电泳

2.2 PCR产物克隆与重组质粒鉴定

从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，与pMD18-T载体相连接，转化感受态细胞DH5α。挑选LB培养基上耐Amp菌落提取质粒DNA样本，PCR扩增鉴定，得到约492 bp条带，与预期结果一致（图2）。

图2 ORF112重组表达质粒PCR产物电泳

2.3 ORF112基因核苷酸序列测定及同源性分析

将鉴定的重组质粒送大连宝生物工程有限公司测序，山羊痘病毒的ORF112基因均为492 bp。将此ORF112基因核苷酸序列与国内外不同来源羊痘病毒株的相应序列进行比较，结果见图3。

图3 ORF112基因核苷酸序列比对

山羊痘毒株（GTPV-S-1）的ORF112基因序列与不同来源的山羊痘病毒分离株比较，ORF112基因核苷酸序列的同源性达到86.8%以上。同源性分析结果表明，山羊痘病毒的ORF112基因具有高度保守性。

3 讨论

山羊痘病毒在病毒形态、理化特性和血清学反应上与绵羊痘病毒和牛疙瘩皮肤病病毒没有区别，均属于羊痘病毒属，主要是按照易感宿主划分的［1］。

早期研究发现，羊痘病毒IMV囊膜上的P32蛋白是一个重要的免疫保护性抗原，接种重组P32蛋白的动物可以产生特异性的中和抗体，并能部分抵御强毒攻击。近年来基于痘苗病毒的大量研究发现，A27L、L1R等其他IMV囊膜蛋白以及B5R、A33R等胞外包膜病毒粒子（EEV）表面的囊膜蛋白在痘病毒免疫中同样发挥着重要作用，因此，研究者也逐渐将注意力转移到GTPV IMV和EEV的其他囊膜蛋白。作为IMV囊膜上另外一个重要的蛋白质，A27L可以诱导针对IMV的高水平中和抗体和淋巴细胞增殖反应，免疫A27L蛋白的小鼠可以抵御痘苗病毒的攻击。由于GTPV ORF112编码产物与痘苗病毒A27L蛋白同源［2］，推测它也是GTPV的一个关键免疫保护性抗原，在GTPV的免疫应答中发挥重要作用。

本试验对所保存的山羊痘毒株（GTPV-S-1）的ORF112基因进行测序，其核苷酸序列与不同来源的山羊痘分离株的同源性达86.8%以上，显示了山羊痘病毒ORF112基因的高度保守性。这为进一步研究山羊痘病毒ORF112基因的表达及其免疫原性、结构与功能奠定了基础。

［1］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997：960-963.

［2］Tulman E R，Afonso C L，Lu Z，et al.The genomes of sheeppox and goatpox viruses［J］.J Virol，2002，76（12）：6054-6061.

［3］Knipe D M，Howley P M，Griffin D E，et al.Fields virology ［M］.4th ed.Philadelphia：Lippincott Williams and Wilkins，2001：2849-2883.

［4］Hooper J W，Custer D M，Thompson E.Four-gene-combination DNA vaccine protects mice against a lethal vaccinia virus challenge and elicits appropriate antibody responses in nonhuman primates［J］.Virology，2003，306（2）：181-195.

［5］Otero M，Calarota S A，Dai A L，et al.Efficacy of novel plasmid DNA encoding vaccinia antigens in improving current smallpox vaccination strategy［J］.Vaccine，2006，24（21）：4461-4470.