淀粉对硫酸黏菌素发酵水平的影响

2018-02-02范家同孙作刚许朋斐

安徽农业科学 2018年4期

范家同，孙作刚，许朋斐，颜卫，曾周

(1.新疆天富阳光生物科技有限公司，新疆石河子 832000；2.新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，新疆乌鲁木齐 830000)

硫酸黏菌素，又称多黏菌素E，为多黏菌素E1、E2和E1-2硫酸盐的复合物。它是由小山康夫在1950年从福岛县土壤中分离到的多黏芽孢杆菌抗敌素变株(Bacilluspolymyxavar．colistinus)产生的，是一种锁环状碱性多肽类抗生素，对革兰氏阴性杆菌如铜绿假单孢菌、鼠伤寒杆菌和痢疾志贺氏菌等有强烈的毒杀作用。其原理如下：硫酸黏菌素中含有带阳电荷的亲脂和疏脂基团，与革兰氏阴性菌细胞膜中的带负电荷的磷脂基团反应，引起细胞膜张力降低和通透性的改变，导致细胞内容物如嘌呤、核苷酸和蛋白等漏出胞外，不能按照正常的调控机制进出细胞内外，导致细胞代谢异常，最终导致细菌死亡[1-11]。淀粉作为碳源能提高发酵液中的多黏类芽孢杆菌菌体浓度[12-13]，同时淀粉相比葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖等碳源，是菌体最适碳源和产多黏菌素E量最高的碳源[14]。在微生物发酵中碳源一般选择葡萄糖，即使使用淀粉作为碳源，也是直接投入基础培养基中使用，很少采用双酶法水解淀粉用于抗生素发酵。笔者使用淀粉和葡萄糖作为复合碳源，通过双酶法水解淀粉控制还原糖的含量，旨在提高发酵水平，为指导大生产提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源。多黏类芽孢杆菌由天富阳光生物科技有限公司菌种组提供。

1.1.2培养基。种子罐培养基:大豆饼粉1.50%，硫酸铵1.90%,七水硫酸亚铁0.02%，大豆油1.00%，泡敌0.02%，磷酸二氢钾0.35%。

原发酵培养基:大豆饼粉1.50%，硫酸铵1.90%,玉米蛋白粉0.50%，七水硫酸亚铁0.02%，大豆油1.00%，泡敌0.02%，磷酸二氢钾0.35%。

现发酵培养基:大豆饼粉1.50%，硫酸铵1.90%,玉米蛋白粉0.50%,玉米淀粉2.00%，七水硫酸亚铁0.02%，大豆油1.00%，泡敌0.02%，磷酸二氢钾0.35%，淀粉酶0.04%，糖化酶0.01%。

1.1.3主要仪器设备。百伦发酵罐(BLB10-15SJ-50SJ-50SJ)，上海百伦生物科技有限公司;灭菌锅(XG1.Y型)，山东新华医疗器械股份有限公司;电子秤(LT202E和LT5001E 型电子天平)，常熟市天量仪器有限公司;岛津高效液相色谱仪(SPD-20A)。

1.2方法

1.2.1种子罐消毒和培养。在不锈钢桶里投入大豆饼粉、硫酸铵、七水硫酸亚铁和磷酸二氢钾，充分溶解后，倒入种子罐，再加入大豆油和泡敌，定容体积至14.5 L,消后体积16.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

种子罐培养条件：(33±1)℃，搅拌(300±20)r/min,风量(0.25±0.05)m3/h,罐压(0.03±0.01)MPa。

1.2.2发酵罐消毒和培养。

1.2.2.1原发酵配方消毒。在不锈钢桶里溶解大豆饼粉、玉米蛋白粉、硫酸铵、七水硫酸亚铁、磷酸二氢钾，加入大豆油和泡敌，定容体积至29.0 L,消后体积32.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

1.2.2.2现发酵配方消毒。淀粉加酶不液化和糖化:在不锈钢桶里加入玉米淀粉、淀粉酶、糖化酶、豆饼粉、玉米蛋白粉、硫酸铵、七水硫酸亚铁、磷酸二氢钾，溶解充分后，倒入发酵罐，加入大豆油和泡敌，定容体积至29.0 L,消后体积32.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

淀粉加酶液化和糖化20 min:在不锈钢桶里加入玉米淀粉和淀粉酶，溶解充分后，倒入发酵罐，加水定容至10.0 L，升温至80.0～84.0 ℃，保温液化20 min，降温到60.0～62.0 ℃，加入糖化酶，保温糖化20 min，升温至100 ℃灭活糖化酶10 min。淀粉糖化后，加入溶解好的豆饼粉、玉米蛋白粉、硫酸铵、七水硫酸亚铁、磷酸二氢钾，再加入大豆油和泡敌，定容体积至28.0 L,消后体积32.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

淀粉加酶液化和糖化40 min:在不锈钢桶里加入玉米淀粉和淀粉酶，溶解充分后，倒入发酵罐，加水定容至10.0 L，升温至80.0～84.0 ℃，保温液化40 min，降温到60.0～62.0 ℃，加入糖化酶，保温糖化40 min，升温至100 ℃灭活糖化酶10 min。淀粉糖化后，加入溶解好的豆饼粉、玉米蛋白粉、硫酸铵、七水硫酸亚铁、磷酸二氢钾，再加入大豆油和泡敌，定容体积至28.0 L,消后体积32.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

淀粉加酶液化和糖化60 min:在不锈钢桶里加入玉米淀粉和淀粉酶，溶解充分后，倒入发酵罐，加水定容至10.0 L，升温至80.0～84.0 ℃，保温液化60 min，降温到60.0～62.0 ℃，加入糖化酶，保温糖化60 min，升温至100 ℃灭活糖化酶10 min。淀粉糖化后，加入溶解好的豆饼粉、玉米蛋白粉、硫酸铵、七水硫酸亚铁、磷酸二氢钾，再加入大豆油和泡敌，定容体积至28.0 L,消后体积32.0 L，消毒(120～122 ℃，30 min)。

1.2.3消后还原糖测定。发酵液的消后还原糖含量检测采用碘量法[15]。

1.2.4种子罐移种和发酵培养。种子罐培养24 h左右，菌体较粗壮，菌量较多时移种,移种量3 L。

发酵培养条件：(34±1)℃，搅拌(300±50)r/min,风量(1.00±0.20)m3/h,罐压(0.03±0.01)MPa。

发酵罐接种后补加35%的葡萄糖溶液至还原糖含量为10 g/L，当还原糖低于6 g/L时开始补糖。发酵过程补加35%的葡萄糖溶液，控制还原糖范围：0～10 h为6～10 g/L，10～24 h为4～6 g/L，24～90 h为2～4 g/L。

1.2.5硫酸黏菌素效价测定。使用高效液相色谱技术测定发酵罐的硫酸黏菌素效价。

色谱条件：色谱柱 C18，柱温 30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长215 nm，进样量 20 μL，运行时间 30 min。

试剂配制：①混合溶剂。将水∶己腈按4∶1混合，过滤，待用。②参比溶液。将25.0 mg标准品用混合溶剂溶解并定容至50 mL。③样品溶液。取滤液2.5 mL,置50 mL容量瓶中，用纯化水稀释至刻度。

检测方法：首先进样参比溶液2针，记录相关峰面积，再进样样品溶液1针，记录相关峰面积。计算公式如下：

总含量(μg/mL)=E1含量+E2含量

2 结果与分析

2.1种子液移种前的涂片图1是种子液培养24 h的移前涂片。可以看出菌体粗壮、菌形均匀整齐、菌量较多，表明种子液的质量很好，是较好的移种时机[16]。

图1 种子液的涂片Fig.1 The smear of seed broth

2.2发酵结果对原配方以及现配方加酶处理0、20、40和60 min的还原糖和发酵效价做曲线，如图2所示。

图2 还原糖含量和发酵水平曲线Fig.2 The curves of reducing sugar content and fermentation level

从图2可以看出，原配方和加酶没有处理的现配方的还原糖含量为0.1 g/L，说明原配方基本不含还原糖，没有升温处理的现配方，由于处理时间和温度不够，也没有还原糖。现配方加酶处理时间越长，水解的还原糖量越高，水解60 min(9.2 g/L)>水解40 min(6.9 g/L)>水解20 min(5.3 g/L)。说明淀粉水解需要一定的作用时间。加淀粉的发酵水平高于原配方发酵水平：20 min时21 178 μg/mL、40 min时20 651 μg/mL、60 min时20 230 μg/mL和0 min时20 146 μg/mL均大于原配方(19 750 μg/mL)，说明淀粉能够提高发酵水平。现配方加酶处理的时间不同，发酵水平也不同：20 min(21 178 μg/mL)>40 min(20 651 μg/mL)>60 min(20 230 μg/mL)>0 min(20 146 μg/mL)。说明淀粉的水解程度影响发酵水平。

3 结论与讨论

近年来，随着对碳源的研究，很多研究报道淀粉可以提高硫酸黏菌素的发酵液菌浓度和发酵水平，但是没有后续的研究，这些技术手段很难推广到发酵大生产中。而该试验的小试罐发酵控制条件和大生产紧密联系，数据和方法可以作为大生产的依据，对大生产来说，具有较好的指导意义。

通过对比原配方和加酶没有处理的现配方的还原糖含量，说明原配方中基本不含还原糖。虽然原配方中的玉米蛋白粉含15%左右的淀粉[17]，但是由于没有加酶液化，所以没有还原糖水解出来。而加淀粉的配方由于升温速度很快，很短的时间就超过100 ℃，酶的活性降低和失活[18]，淀粉也没有水解。

现配方加酶处理时间越长，水解出的还原糖量越高，验证了张剑等[19]的双酶法水解淀粉里提到的处理20～120 min的还原糖含量随着时间的延长而产量增加。

加淀粉的发酵水平高于原配方发酵水平，说明淀粉可以提高发酵水平。孙仲奇等[14]研究了葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和可溶性淀粉等碳源对多黏菌素E合成的影响，结果表明：最终发酵水平由高到低依次是淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖。同时王成迎[20]的硫酸黏杆菌素菌种选育与发酵工艺研究显示，淀粉可以提高菌浓度，使用淀粉和葡萄糖复合碳源对抗生素的合成有利。淀粉配合葡萄糖是最佳的复合碳源，葡萄糖可以促进菌体的生长和初级代谢，为次级代谢提供前提物质，而淀粉可以降低葡萄糖的阻遏效应，提高和延长次级代谢产物的合成量[21]。

现配方加酶处理时间不同，发酵水平也不同。原因可能是还原糖量不同，对应发酵水平不同。刘铁军等[22]研究了葡萄糖浓度对杆菌肽发酵过程的影响，结果表明：在基础料中葡萄糖含量为5 g/L时，发酵前期菌体生长较快，且发酵液中的乙酸(发酵中大量葡萄糖存在时，会产生乙酸，对次级代谢产物的合成起抑制作用)累积较少，最终菌量较低，后期杆菌肽产生速度较慢，最终产量很低；当基础料中葡萄糖含量为10 g/L时，菌量较高，发酵液中的乙酸积累较少，同时中后期的杆菌肽的产量合成速度较快，最终的杆菌肽产量较高；当基础料中葡萄糖含量15或20 g/L时,菌量较高，但是发酵液中的乙酸累积也较多，乙酸过多反而抑制菌体合成杆菌肽，影响最终的产量。虽然两者的发酵产物不同，但是试验现象相似，与该试验的结果也基本一致。试验中用酶处理20 min的消后培养基的还原糖含量为5.3 g/L，接种后补至10.0 g/L，最后的发酵水平最高，效价为21 178 μg/mL。处理0 min的消后培养基的还原糖含量为0.1 g/L，效价最低，为20 146 μg/mL。原因可能是接种后补充到10.0 g/L后，较高浓度的葡萄糖浓度在代谢中产生了糖代谢阻遏效应，抑制了硫酸黏菌素合成相关基因转录和酶的活性，导致合成受阻，最终效价偏低。另一方面，淀粉的利用率有限，当基础料中有葡萄糖存在时，优先利用葡萄糖。因为葡萄糖是速效碳源，只有当葡萄糖被利用后，淀粉这类的迟效碳源才会被利用。微生物的细胞经济学假说认为，在微生物的代谢活动中，存在着以最少的耗费获得最大的经济效益现象。该试验中菌体如果要利用淀粉，则需要分泌分解淀粉的一系列酶，最后转化为葡萄糖再利用，从而浪费了能量。处理40和60 min的消后培养基的还原糖含量分别为6.9和9.2 g/L，效价分别为20 651和20 230 μg/mL。虽然接种后，通过补糖，还原糖含量为10.0 g/L，但是效价偏低。原因是淀粉酶解过程的产物不是单一的葡萄糖，还有麦芽糖，麦芽糖也是还原糖，所以最终的葡萄糖含量达不到10.0 g/L，造成效价偏低。而20 min的还原糖含量偏低，加上补充的葡萄糖，发酵液中的葡萄糖含量高于处理40和60 min的葡萄糖含量，更接近于文献中的10.0 g/L，所以发酵水平最高。处理40 min的发酵水平比60 min高一些，也是这个原因。

因此，淀粉可以提高发酵水平，配合葡萄糖是最佳的复合碳源。同时控制淀粉水解时间20 min,还原糖含量5.3 g/L的发酵水平最高。

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