肿瘤相关成纤维细胞在大肠癌发生发展中的研究进展

吕 强 陈洪生 李国东 魏九峰 综述 刘 明 审校

大肠癌(Colorectal cancer，CRC)是人类主要恶性肿瘤之一，每年全球有约120万名患者被确诊为大肠癌，超过60万名患者直接或间接死于CRC。肿瘤的发生发展与其生存环境密切相关，这种由肿瘤细胞本身、肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated-fibroblasts，CAFs)、免疫细胞、血管内皮细胞以及细胞外基质等共同构成的内环境称之为肿瘤微环境[1]。其中，CAFs是肿瘤微环境中的主要细胞成分。近年来研究发现，CAFs通过与肿瘤细胞及其他类型细胞发生相互作用，分泌多种细胞因子，进而促进肿瘤的增殖、侵袭及转移，在CRC的发生发展中发挥重要作用。

1 CAFs概述

成纤维细胞是基质中的一种主要细胞类型，通过提供结构支架和分泌纤维连结蛋白等细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)成分，促进组织发育并维持组织内稳态。在肿瘤微环境中存在活化的成纤维细胞，被称为CAFs或肿瘤间质细胞。CAFs外形呈纺锤形，具有很强的增殖和迁移能力。研究表明，CAFs在肿瘤生长、侵袭、转移以及耐药性等方面起着至关重要的作用，且间质中较高含量的CAFs与CRC患者较差的预后有关[2]。

CAFs具有高度异质性，这主要体现在其来源广泛，生物标记物多样等特征。CAFs的生物标记物包括：α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、成纤维细胞活化蛋白α(Fibroblast activation protein-α，FAP-α)、成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP-1)、神经/胶质细胞抗原2(Neuron-glial antigen-2)、血小板衍生生长因子受体(Platelet derived growth factor，PDGF)、脯氨酰羟化酶(Prolyl hydroxylase)等[3]。CAFs的生物标记物虽然众多，但都缺乏特异性。在肿瘤生物学当中，CAFs虽然是研究最多的细胞类型之一，但由于其缺乏特异性生物标记物使得我们对CAFs的最终来源还不确定。目前已知的CAFs的可能来源包括肿瘤组织自身成纤维细胞的活化、骨髓来源干细胞分化、上皮细胞通过上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)等[4]。越来越多的证据表明，CAFs在结肠癌组织当中具有高度异质性。CAFs可由肿瘤微环境中的肿瘤细胞及其他类型细胞间的相互作用而产生。因此，肿瘤微环境的异质性可以引起CAFs的广泛变异。

2 CAFs的募集与活化

正常体内成纤维细胞能够抑制肿瘤细胞的增殖[5]，此外，正常肠成纤维细胞能维持上皮内稳态以防止癌变[6]。肿瘤细胞通过分泌趋化因子CXCL12、PDGF、白细胞介素6(IL-6)等各种因子诱导成纤维细胞向CAFs转变[7-8]。实验发现，CAFs在被招募和激活后，并不需要诱导因素的持续存在。这可能是由于在分化过程中，CAFs获得不可逆转的遗传和/或表观遗传改变，从而达到更稳定的活化细胞状态[9]。此外，正常的上皮细胞和上皮来源的肿瘤细胞也是CAFs的另一可能来源。有研究表明在慢性炎症情况下，上皮细胞可通过EMT过程获得成纤维细胞样表型并参与纤维基质的合成。

有研究者通过建立小鼠消化道肿瘤模型发现，大部分CAFs来源于骨髓间充质干细胞，并通过TGF-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)和CXCL12相互作用的方式被招募至肿瘤部位[10]。因此，CAFs可能是通过趋化因子和其他成纤维细胞因子如TGF-β之间的协同调节作用而被募集。TGF-β是促进成纤维细胞向CAFs转变的重要刺激因素之一。TGF-β通过增加CAFs内α-SMA的表达，诱导其增殖、黏附和迁移能力变化，刺激胶原蛋白、ECM酶生长因子、细胞因子和趋化因子的分泌效应，以激活成纤维细胞[3]。

3 CAFs对大肠癌的作用

3.1 CAFs对CRC增殖的作用

肿瘤细胞增殖被认为是肿瘤发生迁移、侵袭的必要过程。在肿瘤生长过程中，CAFs通过自分泌及旁分泌的方式分泌多种细胞因子和生长因子，如干细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、表皮生长因子(EGF)、TGF-β、上皮调节蛋白及胰岛素样生长因子(IGF)等以促进肿瘤细胞增殖[6，11-12]。

CRC组织中CAFs分泌的HGF，通过激活β-catenin信号通路，进一步诱导肿瘤干细胞的克隆能力，促进CRC细胞增殖。而且HGF能够修复肿瘤干细胞表型特征，为肿瘤细胞向更高级别分化提供基础[13]。研究表明，由CAFs产生的TGF-β有助于维持肿瘤细胞微环境中肿瘤细胞的恶性表型，刺激CRC组织肿瘤上皮细胞增殖。此外，由CAFs产生的趋化因子CXCL12与受体CXCR4结合后，通过募集血管内细胞，促进肿瘤血管新生，刺激CRC细胞增殖。而且这些生长因子对CAFs自身增殖同样具有促进作用。因此，这些生长因子在CAFs与肿瘤细胞之间形成了一个恶性循环的反馈效应，最终加速CRC的进展[14-15]。

3.2 CAFs对CRC侵袭及转移的作用

肿瘤微环境中的CAFs不仅能够促进CRC细胞增殖，同时可通过肿瘤细胞间的相互作用分泌各种生长因子及趋化因子，进而促进CRC的侵袭及转移。实验表明，将CRC细胞系与CAFs共培养时，细胞的迁移及克隆形成能力均明显增加[4]。此外，将CAFs与人CRC细胞联合注射到裸鼠体内，肿瘤细胞的增殖也显著增强。基因本体论分析进一步揭示了CAFs中过表达的基因与细胞生物学过程，包括发育(TGFB2、PDGFC、cMET、CADM1、WNT1)和细胞信号转导(TFAP2C、NTF-3、SEMA5A、EFNB2、INHBA)等通路[16]。这些基因产物可以调节CRC细胞的功能，促进CRC细胞的侵袭和转移。

CAFs可通过细胞之间的相互作用分泌产生基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)。MMPs不仅可以促进EMT发生，进而促进癌细胞的生长和转移，还可以导致细胞外基质内基底膜蛋白水解破坏，改变肿瘤微环境，增强肿瘤细胞的侵袭能力。此外，CAFs分泌的MMPs可通过裂解表达于肿瘤细胞表面的蛋白酶激活受体1(Proteinase-activated receptor 1，PAR1)，增强肿瘤细胞的侵袭能力。研究表明，CRC细胞与CAFs在肿瘤侵袭过程中发生相互作用，导致β-连环蛋白活性增加，从而激活结肠癌细胞的Wnt信号通路，促进其迁移与转移[17]。

基于肿瘤基因表达谱的分类方法，发现了一种具有间质特征的侵袭性结肠癌亚型。比较分析高基质含量与低基质含量的CRC细胞显示，在高基质含量肿瘤组织中的肿瘤细胞表达特定的EMT驱动因子，包括ZEB2、TWIST1和TWIST2[18]。并且，I型胶原蛋白是这些侵袭性结肠癌细胞基质的主要成分。肿瘤微环境中，I型胶原蛋白能够诱导结肠癌细胞表达肿瘤特异性间质基因，抑制肝细胞核因子4基因表达，激活上皮分化转录，促进CRC细胞侵袭。

肿瘤细胞在发生转移之前，会在预转移部位形成特殊的微环境以利于肿瘤细胞转移。CAFs分泌的细胞因子及其介导细胞外基质重塑可以帮助形成适合肿瘤细胞的预转移微环境。研究表明，S100A4阳性CAFs能够产生大量VEGF-A[19]。VEGF-A对肿瘤转移部位的血管生成、微环境建立及转移灶定植具有重要作用。此外，S100A4阳性CAFs产生的肌腱蛋白C能够激活肿瘤细胞中的Wnt和Notch通路，保护肿瘤细胞避免凋亡。另有研究表明，肿瘤细胞可通过相互作用与周围的CAFs结合，发生共同转移，以利于转移部位肿瘤细胞的生长。

CAFs能激活癌细胞STAT3通路，促进肿瘤进展。CRC常表现为TGF-β通路的突变失活伴随高转化因子TGF-β的产生。肿瘤细胞中TGF-β能够刺激CAFs分泌白细胞介素-11(IL-11)，触发肿瘤细胞gp130/STAT3信号通路激活[20]。这种方式可以提供具有生存优势的转移细胞，利于肿瘤细胞转移。综上，CAFs在CRC的侵袭及转移中发挥重要作用。

3.3 CAFs对CRC耐药性的作用

肿瘤细胞的快速增殖是一个极其耗能的过程，无氧糖酵解增加及乳酸堆积是肿瘤细胞能量代谢的一个重要特征。CAFs无氧糖酵解的增强产生大量乳酸，使得肿瘤细胞内外环境酸碱度发生改变，这一变化影响了药物在肿瘤中的聚集与药效的发挥，并且使肿瘤细胞产生了耐药性。

由CAFs构成的肿瘤细胞外基质对癌症化疗具有影响。细胞外基质形成了一个天然的物理屏障，因此大多数抗癌药物对实体肿瘤的穿透能力有限。此外，癌细胞与ECM结合后，通过激活PI3K/Akt、ERK和Rho/Rock在内的多种生存信号通路而获得耐药性[21]。例如小细胞肺癌细胞对ECM的黏附作用赋予其对化疗药物的抵抗力。由于黏附作用激活β整合素刺激的酪氨酸激酶，最终抑制化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡。类似机制在CRC细胞耐药性产生中也起到一定作用。

除了ECM，CAFs分泌的多种可溶性因子也被证明参与了肿瘤耐药，如CAFs分泌的趋化因子CXCL12参与介导肿瘤细胞产生对传统化疗药物的抵抗作用[22]。在CXCR4表达的肿瘤细胞中，CXCL12通过激活黏着斑激酶(FAK)、ERK、β-连环蛋白等降低肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性。实验证明，将奥沙利铂或5-氟尿嘧啶处理后的结肠癌细胞与CAFs共培养，CAFs及其分泌的多种因子可促进CRC细胞的生长和增殖。

CRC启动细胞(CRC initiating cells，CIC)在细胞自检中会对常规化疗产生耐药性，而且CAFs也能够增加CIC的耐药性。比较分析CRC患者经细胞毒性治疗前后的组织样本，发现CAFs在经过治疗后数量显著增加。经化学药物治疗后，患者体内CAFs促进CIC的自我更新，并且体内肿瘤的生长也与特异性细胞因子和趋化因子分泌增加有关，如白细胞介素-17A(IL-17A)[14]。CAFs分泌的IL-17A能够增加CIC的自我更新及侵袭能力。这些数据表明，化疗药物通过激活CAFs分泌IL-17A等细胞因子，从而诱导肿瘤微环境的重塑，增加肿瘤耐药性。

3.4 CAFs对肿瘤微环境的作用

炎症反应被认为与CRC发生具有密切关系。CAFs作为肿瘤相关炎症的主要细胞成分，通过诱导依赖性促炎症基因NF-κB的表达进而介导肿瘤炎症反应的增强。NF-κB能够活化增强炎症趋化因子如CCL2以及环氧合酶2(Cyclooxygenase 2，COX-2)在CAFs中的表达。CAFs分泌的CCL2能够介导血管内单核细胞募集至肿瘤部位，有利于具有强促癌性的肿瘤相关巨噬细胞生成。同时，COX-2可以产生前列腺素E2，促进恶性结肠上皮细胞增殖[23]。

CAFs对肿瘤微环境的另一个显著影响是它们能够重塑ECM[24]。CAFs通过分泌I型胶原蛋白，癌胚纤维连接蛋白剪接变异体，骨膜以及透明质酸等特定的ECM，促进肿瘤生长。CAFs也可通过分泌赖氨酰氧化酶(Lysyloxidase，LOX)介导I型胶原蛋白的共价交联。LOX催化的交联反应及肿瘤组织刚性增强都与肿瘤发生有直接关系。机械应力能够激活CAFs分泌MMPs，后者能够调节ECM的降解，促进肿瘤细胞的侵袭。

肿瘤微环境中含有丰富的新生血管，CAFs分泌的MMP一方面通过降解血管内皮细胞的基底膜结构，另一方面通过释放VEGF与细胞外基质结合，最终导致肿瘤新生血管形成。此外，CAFs是趋化因子CXC的重要来源之一，SDF-1/CXCL12能够将内皮祖细胞募集至肿瘤细胞处并促进肿瘤新生血管形成。低氧可使CAFs表达缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)，从而诱导VEGF表达，促进血管生成[25]。

4 临床应用

4.1 CAFs与CRC预后的相关性

Huijbers等[26]研究发现，临床II期及III期的CRC术后患者，切除肿瘤组织中含有大量α-SMA阳性CAFs或肿瘤内基质比例较高的患者，预后往往较差。CAFs产生大量FAP-α和SDF-1/CXCL12，肿瘤内高表达的基质蛋白FAP-α倾向于更严重的疾病进展，并且可能伴有肿瘤的转移或复发。而且肿瘤内FAP-α与SDF-1的高表达也与直肠癌患者新辅助治疗后肿瘤复发有关。

目前可将CRC分为四个分子亚型：CMS1(MSI免疫型)、CMS2(经典型)、CMS3(代谢型)及CMS4(间质型)。其中，CMS3亚型具有参与基质重塑和EMT基因上调的特征，并且患者预后较差。更详细的分析表明，对于CRC患者预后情况的预测，主要来自于基质细胞表达基因[27]。CAFs可以增加CIC频率，而且TGF-β通路进一步增强了这种作用。此外，预后不良的CRC，在肿瘤基质细胞中显示TGF-β诱导的基因程序。这些结果表明，CAF介导的基因表达谱可用于预测结肠癌患者的预后。

4.2 CAFs在CRC治疗中的作用

近年来，随着对于CAFs在肿瘤发生、发展和转移中作用及机制的深入研究，针对CAFs的肿瘤靶向治疗也得到了广泛关注。Kraman等[28]发现，在小鼠肺癌模型当中，去除FAP阳性细胞会引发肿瘤免疫反应，致使癌细胞和基质细胞快速缺氧坏死。利用FAP特异性抗体治疗清除FAP阳性的CAFs，在动物模型上取得了较好的抑制肿瘤细胞生长、转移的效果。然而后续的研究表明，FAP阳性细胞是体内卵泡抑素的主要来源，去除FAP阳性细胞会导致肌肉质量下降，B淋巴细胞和红细胞数量减少。因此，肿瘤组织中FAP阳性细胞耗竭是引起患者贫血及恶病质的原因之一[29]。将FAP作为消除CAFs的治疗靶点应用于临床还有待研究。

研究表明，在结肠癌发生过程中，CCL3-CCR5轴参与的AOM/DSS通路对于募集和活化CAFs起到重要作用。对小鼠肿瘤模型系统性给予CCR5拮抗剂表达载体，能使肿瘤组织缩小，肿瘤周围CAFs数量减少。并且趋化因子CXCL12拮抗剂能抑制CAFs分泌的整合素β1在肿瘤细胞表面聚集，降低胃癌细胞侵袭能力[30]。由此可见，CXCL12/CXCR4信号通路抑制剂在CRC肿瘤治疗中具有广泛前景。

5 小结与展望

CAFs作为肿瘤微环境的重要组成部分之一，在肿瘤的发生发展中起着重要作用。并且CAFs现已作为癌症治疗的一个重要靶点得到广泛研究。但是关于CAFs与肿瘤细胞之间相互作用的机制，CAFs促使肿瘤细胞产生免疫耐受及治疗抵抗的机制等问题还有待进一步研究。因此，对于CAFs的深入研究，有益于揭示肿瘤发生发展的具体机制，并为肿瘤治疗提供新的研究方向。